探討PCR技術(shù)于檢驗(yàn)沙門菌中的應(yīng)用與進(jìn)展

李立巍

桂林市疾病預(yù)防控制中心，桂林 541001

革蘭氏陰菌中之一的沙門菌，屬于腸道細(xì)菌科沙門氏菌類別，對(duì)不同血清感染的各種動(dòng)物造成的各種病癥被稱為沙門菌病，常見(jiàn)的是誤食各種發(fā)霉變質(zhì)的食物造成的中毒，造成中毒的病菌，其中就包括沙門菌。接近90%是肉類、蛋類、奶類等畜牧產(chǎn)品［1］。此類畜牧產(chǎn)品具有較為豐富的營(yíng)養(yǎng)元素，大大有利于沙門菌在此類產(chǎn)品中的生長(zhǎng)繁殖。不僅如此，沙門菌的適應(yīng)能力與生命力都較為頑強(qiáng)，可以在一定處于外部環(huán)境的食品中生存幾個(gè)月之久。其不僅可以感染動(dòng)物，還可以導(dǎo)致食用了大量沙門菌食物的人類受到侵害而引發(fā)食物中毒，是導(dǎo)致人類與牲畜之間共同患病的原因其一，在醫(yī)學(xué)上有著極強(qiáng)的代表性。同時(shí)對(duì)食物的安全性具有嚴(yán)重的威脅性［2-3］。

目前沙門菌的檢測(cè)方式更多是采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方式，不僅周期性長(zhǎng)，而且相對(duì)復(fù)雜繁瑣。因此，針對(duì)沙門菌的檢測(cè)如何實(shí)現(xiàn)快速且有效的檢測(cè)技術(shù)研究具有重要的實(shí)用意義。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，依靠免疫學(xué)與生物學(xué)為標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)應(yīng)用將進(jìn)一步細(xì)菌細(xì)分檢測(cè)范疇［4-5］。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的廣范應(yīng)用，不僅進(jìn)一步提高了對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)速度，而且還具有較為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果依據(jù)。PRC技術(shù)不但可以從定性與定量?jī)蓚€(gè)維度進(jìn)行檢測(cè)，還有利于快速檢測(cè)體系的建立與進(jìn)一步提高檢測(cè)反應(yīng)靈敏度，其核心在于選擇被檢測(cè)目標(biāo)的基因［6-7］。

沙門菌等致病菌概述

此類病菌是依附在人類與動(dòng)物消化系統(tǒng)中的生化反應(yīng)，與革蘭陰性桿菌的抗原構(gòu)成較為相似，是導(dǎo)致消化系統(tǒng)腸道患病的病菌之一，造成的疾病大致由兩類組成：第一種是傷寒與副傷寒，第二種是較為常見(jiàn)的急性腸胃炎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國(guó)范圍內(nèi)由沙門菌造成的食物中毒數(shù)量位列第1 位，其中細(xì)菌導(dǎo)致的食物中毒，大部分是沙門菌造成的；食品類別中進(jìn)一步細(xì)分，肉類等占據(jù)絕對(duì)核心原因，因其富含更多種類的人體所需的營(yíng)養(yǎng)元素，更有利于沙門氏菌的繁衍。如果食用帶有大于一定數(shù)量的沙門菌的肉類食品，將造成人體被感染。沙門菌是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一［8-9］。沙門菌污染的食物被人類與動(dòng)物食用，是該疾病重要的感染方式之一。

沙門菌檢驗(yàn)技術(shù)

血液與排泄物是用于臨床提取檢測(cè)樣本的基礎(chǔ)，常用于已被感染的對(duì)象進(jìn)行沙門菌的檢測(cè)，食品安全檢測(cè)原理與臨床病料中實(shí)質(zhì)性是相同的。但在食品檢測(cè)分析應(yīng)用中是受到因素制約的，首先是兩者的沙門菌的含量是不同的，食品中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于臨床病料；其次食品本身易受到其他病原的干擾；最后經(jīng)過(guò)人工處理的食品，經(jīng)過(guò)外部因素干擾的作用，會(huì)導(dǎo)致沙門菌受到損傷或者細(xì)菌死亡［10-11］。傳統(tǒng)檢測(cè)方式具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、反應(yīng)過(guò)程繁瑣、反應(yīng)試劑較多以及靈敏度低等不足，而且檢測(cè)方式是通過(guò)表面抗原，研究判斷生化反應(yīng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)［12］。隨著生物科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在實(shí)踐中不斷優(yōu)化與提升檢測(cè)手段，可以在更短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出目標(biāo)檢測(cè)物的結(jié)果，這類方式被稱為快速檢測(cè)。該檢測(cè)技術(shù)對(duì)沙門菌以及其他樣品病原PCR方法的專業(yè)體系已得到廣泛的應(yīng)用。

PCR技術(shù)

1、PCR概述

PCR 技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其原理是將指定的DNA 片段通過(guò)PCR 技術(shù)將其放大增多的技術(shù)方式，可理解為將提取的DNA 樣本重新進(jìn)行循環(huán)復(fù)制，將少量的DNA 進(jìn)行更進(jìn)一步的增多，這是PCR 的核心技術(shù)特征。PCR 是1985 被發(fā)明出來(lái)，其發(fā)明者是美國(guó)的專家Mullis，標(biāo)志著此項(xiàng)技術(shù)的問(wèn)世。PCR 儀是由聚合酶衍生而出的控制溫度的技術(shù)設(shè)備，可以精準(zhǔn)控制溫度的變化過(guò)程，從而達(dá)到檢測(cè)樣本目的。

特異性強(qiáng)、靈敏度高、迅速精準(zhǔn)、自動(dòng)化程度高等是PCR 的特點(diǎn)，以驚人的速度被廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個(gè)專業(yè)領(lǐng)域，同時(shí)又結(jié)合其他相關(guān)技術(shù)衍生出更多的PCR 技術(shù)［13-14］。PCR 技術(shù)原理是依托以單鏈DNA 為檢測(cè)樣品，基于檢測(cè)需要的環(huán)境條件下，采用人工合成品為引物，基于PCR 技術(shù)手段進(jìn)行增加檢測(cè)樣品DNA 的方式。這個(gè)過(guò)程主要分為3 個(gè)步驟：第一是高溫變性，第二是低溫復(fù)性，第三是適溫延伸。3個(gè)環(huán)節(jié)流程為一個(gè)單位，循環(huán)往復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)增多DNA 的目的。在整個(gè)PCR 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要重點(diǎn)關(guān)注的是因?yàn)闇囟茸兓瘯?huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)樣本DNA 聚合酶喪失活性，需要在每次循環(huán)過(guò)程中進(jìn)行補(bǔ)充增活操作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)有效性。此類實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法存在一定不足，因此對(duì)PCR 的廣泛普及與未來(lái)空間形成一定制約［15-16］。

2、PCR技術(shù)在沙門菌檢測(cè)中的應(yīng)用

⑴沙門菌檢測(cè)技術(shù)一般可分為常規(guī)PCR、多重PCR、套式PCR。以上方法可單獨(dú)運(yùn)用，也可多種檢測(cè)手段相結(jié)合，從而提高受檢目標(biāo)結(jié)果的精準(zhǔn)度。

⑵常規(guī)PCR是根據(jù)特定提取物目標(biāo)樣品的特異保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)待檢樣本DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析，此方式具備靈敏度高、特異度好、檢測(cè)周期短、簡(jiǎn)單便捷等特點(diǎn)［17-18］。但此技術(shù)同時(shí)也存在一定不足之處，例如出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果以及由于存在使用不同引物的情況，可能對(duì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的影響，造成結(jié)果的偏差性。因此，在利用PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要更為謹(jǐn)慎與專業(yè)的操作，嚴(yán)格按照要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精準(zhǔn)性。詹銘等［19］通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)樣本中沙門菌的hilA 基因用作引物，擴(kuò)增片段在497 by，進(jìn)一步縮短檢測(cè)結(jié)果的同時(shí)又提升精準(zhǔn)度和靈敏度。汪琦等［20］通過(guò)invA的目的基因利用PCR 技術(shù)手段，在48 h 即可得出明確結(jié)果。把生肉、加工雞肉、全脂乳粉列為研究樣品，通過(guò)沙門菌的人工操作干預(yù)，檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方式和BAx（r）系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果相同，最終結(jié)果檢出限是100 cfu/25 g，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。雖然通過(guò)PCR 技術(shù)手段進(jìn)行檢測(cè)，具有迅速、精準(zhǔn)、周期短等優(yōu)勢(shì)，不過(guò)不足之處也較為明顯，就是對(duì)于細(xì)菌是無(wú)法區(qū)別是否擁有活性?；钚约?xì)菌是對(duì)食物中毒等致病菌來(lái)說(shuō)檢測(cè)的意義。常規(guī)PCR 在檢測(cè)中容易受到污染，影響檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性，不過(guò)目前伴隨著PCR技術(shù)的迅速提升，影響檢測(cè)結(jié)果精準(zhǔn)性易受污染的因素已經(jīng)消除。

⑶多重PCR 與常規(guī)PCR 只能針對(duì)1 對(duì)引物的優(yōu)勢(shì)在于可以增加2對(duì)以上引物，可實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)DNA 的反應(yīng)，此類方式與其他檢測(cè)方式（常規(guī)PCR）在多個(gè)方面具有高度一致性，而且擁有更高效、更便利、成本低等優(yōu)勢(shì)。沙門菌等致病菌的檢測(cè)手段上多重PCR 已被廣泛運(yùn)用，大大提高了檢測(cè)速度；但多重PCR 檢測(cè)手段也存在一定劣勢(shì)，靈敏度、效率等低于常規(guī)PCR 檢測(cè)手段［21］。因此，突破現(xiàn)有檢測(cè)條件是大家所面對(duì)的問(wèn)題，也是一起尋找研究解決的難點(diǎn)，把多種影響因素優(yōu)化排查，最終建立適宜的多種PCR反應(yīng)體系。

⑷實(shí)時(shí)熒光定量PCR：1996 年美國(guó)Applied Biosystems公司率先使用，在PCR反應(yīng)體系中添加熒光基團(tuán)，借助熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)觀察PCR 反應(yīng)過(guò)程，把標(biāo)準(zhǔn)曲線與被檢測(cè)目標(biāo)物通過(guò)定量分析方式的檢測(cè)手段被稱為實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)的問(wèn)世，完成了PCR 由定性到定量質(zhì)的跨越。比常規(guī)PCR 具有更多優(yōu)勢(shì)，不僅解決了PCR 易受到污染的問(wèn)題，而且具備更強(qiáng)的特異性與更高的自動(dòng)化程度等特點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)大規(guī)模用于沙門菌檢測(cè)領(lǐng)域。岳昌武等［22］通過(guò)此技術(shù)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)迅速、有效、精準(zhǔn)地檢測(cè)出目標(biāo)物中沙門菌，而且靈敏度已經(jīng)達(dá)到10 cfu/g，所需的檢測(cè)時(shí)間僅4～10 h，即可對(duì)目標(biāo)樣本得出精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。鄭友限等［23］以食物和實(shí)驗(yàn)細(xì)菌為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)樣本，實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量方式獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與其他檢測(cè)技術(shù)手段進(jìn)行對(duì)比，此檢測(cè)技術(shù)靈敏度可達(dá)102 cfu/ml，而且可在24 h 內(nèi)獲得精準(zhǔn)結(jié)果，因此針對(duì)沙門菌的檢測(cè)技術(shù)手段又取得更進(jìn)一步的發(fā)展。鐘偉軍等結(jié)合熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)所需的條件與自身特征的進(jìn)一步研究，利用進(jìn)行編碼的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)引物等相關(guān)需求，重新建立了新的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法。方平等［24］利用其他物質(zhì)的特定性質(zhì)，可精準(zhǔn)進(jìn)行沙門菌特征的結(jié)果反應(yīng)，利用溫度調(diào)節(jié)方式，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的識(shí)別分類，達(dá)到畜牧產(chǎn)品中沙門菌的檢測(cè)識(shí)別技術(shù)，通過(guò)兩種肉類目標(biāo)樣品實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，其靈敏度分別是13、12 cfu/25 g，而整個(gè)檢測(cè)時(shí)間周期可在10 h內(nèi)完成，此檢測(cè)方式擁有方便、快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，但此檢測(cè)方式也有檢測(cè)成本高、檢測(cè)設(shè)備要求高等不足。

結(jié)語(yǔ)

綜上所述，針對(duì)沙門菌等致病菌檢測(cè)技術(shù)中，具備簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確、高效等特征的PCR手段是主要應(yīng)用之一，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，其具備的與傳統(tǒng)檢測(cè)手段不可相比的優(yōu)勢(shì)，尤其是近幾年發(fā)展中迅速崛起的熒光定量PCR技術(shù)，不僅能大大縮短檢測(cè)時(shí)間，而且還能進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度。隨著科技水平的迅猛發(fā)展，以后將會(huì)有更多的新科技、新技術(shù)、新手段來(lái)助力沙門菌檢測(cè)技術(shù)的迭代更新，并得到廣泛普及與運(yùn)用。雖然PCR傳統(tǒng)檢測(cè)方式與新技術(shù)相比存在很多不足，但依然在疾病的診斷與衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)中占有不可或缺的一席之地。不論是哪種技術(shù)手段在實(shí)際運(yùn)用中都會(huì)受到各種條件的約束，因此未來(lái)還需廣大科研人員共同在PCR技術(shù)檢測(cè)沙門菌等致病菌的方面進(jìn)行更進(jìn)一步的探討。