16S rRNA基因測(cè)序分析犬骨癌的癌內(nèi)菌群特征

李 曄,張玉珠,霍俊元,唐明瑞,蔡樺林,孫真真,劉祥雨,謝光洪*,劉 云*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

隨著社會(huì)的進(jìn)步，以及我國(guó)生活水平的提高，伴侶動(dòng)物犬的飼養(yǎng)數(shù)量也大幅度提升，近幾年國(guó)內(nèi)小動(dòng)物醫(yī)學(xué)方面也得到了迅速發(fā)展[1]。骨腫瘤屬于臨床上較為常見的犬骨病，約占組織腫瘤的57%，且惡性骨腫瘤的比例較大，臨床上以跛行、病變處腫脹、骨折為主[2-3]。截肢術(shù)是常采用的治療手段，但是在大多數(shù)病例中不太理想，少數(shù)病例在術(shù)后僅存活6～8個(gè)月。犬骨癌的發(fā)生可能與年齡、品種、外界感染有關(guān)，但是犬骨癌發(fā)病原因尚不清楚，因此臨床上還無(wú)法有效預(yù)防[2,4]。微生物感染是癌癥的發(fā)病因素之一，全世界超過16%的癌癥發(fā)病率歸因于微生物感染[5]，且最近有研究證明，不同類型癌癥的腫瘤內(nèi)均存在細(xì)菌，且其多樣性和組成可以影響宿主的免疫反應(yīng)和疾病的自然病程[6-7]。這些研究提示了調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)細(xì)菌可能成為一種使腫瘤對(duì)治療敏感的新策略。但犬作為人癌癥研究的常用動(dòng)物模型，犬骨癌的癌組織內(nèi)是否含有細(xì)菌，這一問題到目前為止是未知的。

16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)因其高變區(qū)具有屬或種的特異性，可以作為揭示生物物種的特征核酸序列， 被認(rèn)為是細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類的最適合指標(biāo)。迄今，16S rRNA已被廣泛用于腸道、口腔、胃黏膜、乳腺、肺、胰腺、骨癌病變部位等的菌群組成結(jié)構(gòu)研究[8-12]。例如NEJMAN等[8]利用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序分析了1 010例癌癥患者(包括乳腺癌、肺癌、黑色素癌、胰腺癌、卵巢癌、骨癌以及多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的癌組織樣本，結(jié)果表明不同的癌癥類型中菌群豐度不盡相同。

因此，本研究基于16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)，通過提取骨癌患犬的癌組織和癌旁組織的基因組總DNA，進(jìn)行高通量測(cè)序并結(jié)合數(shù)據(jù)分析骨癌患犬的腫瘤內(nèi)是否存在細(xì)菌以及菌群的結(jié)構(gòu)組成、豐度和多樣性，為犬骨癌的早期診斷和新治療手段的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑組織DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；引物由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成；PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶購(gòu)自長(zhǎng)春市生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集6份腫瘤組織(BC)和6份癌旁組織(PBC)均來(lái)源于福州省福州市千寵百愛動(dòng)物醫(yī)院的確診骨癌犬：術(shù)后即刻在無(wú)菌超凈臺(tái)用手術(shù)鋸切割放入1.5 mL無(wú)菌EP管，并快速置于-80℃低溫冰箱中冷凍保存。

1.3 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增通過提取骨癌患犬的癌組織和癌旁組織總DNA來(lái)對(duì)其菌群進(jìn)行分析。首先對(duì)兩種組織分別進(jìn)行研磨，然后利用組織DNA提取試劑盒對(duì)組織的基因組總DNA 進(jìn)行提取，并檢測(cè)DNA的純度和濃度。取適量的組織DNA于高壓滅菌過的1.5 mL EP管中，使用ddH2O將DNA稀釋至1 mg/L。以稀釋后的基因組 DNA 為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶 Barcode 的特異引物(F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)、PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1 min；98℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。最后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并利用膠回收進(jìn)行純化。

1.4 序列測(cè)定高通量序列測(cè)定采用的測(cè)序平臺(tái)是NovaSeq PE250，測(cè)序區(qū)域?yàn)?6S rRNA 的V3-V4區(qū)，序列長(zhǎng)度在250 bp左右，測(cè)序工作由諾禾致源測(cè)序公司完成。

1.5 生物信息分析利用Uparse軟件對(duì)所有樣本的全部數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，以97%相似性將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)。Alpha多樣性指數(shù)使用Shannon、Simpson、Chao 1、ACE、Coverage分析樣本內(nèi)骨癌患犬的癌內(nèi)菌群和癌旁菌群的豐富度和多樣性。Beta多樣性分析體現(xiàn)2組之間的差異程度。應(yīng)用LEfSe分析尋找組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物，展現(xiàn)不同組中豐富顯著的菌種。選取豐富度排名前35的功能及它們?cè)诿總€(gè)樣品中的豐富信息，并從功能差異層面進(jìn)行聚類，并進(jìn)行Tax4Fun功能預(yù)測(cè)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Wilcox秩和檢驗(yàn)對(duì)犬骨癌癌內(nèi)菌群與癌旁菌群的α多樣性指數(shù)進(jìn)行差異比較，組間差異菌群分析采用t檢驗(yàn)對(duì)組間的菌群豐富數(shù)據(jù)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)以篩選差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的菌群。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OTUs分析為了研究骨癌患犬的癌內(nèi)菌群，對(duì)6例患犬的細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測(cè)序用于比較癌組織與癌旁組織之間的菌群特征。由表1可知，12個(gè)組織樣品(6個(gè)癌組織與6個(gè)癌旁組織)共獲得766 209條原始序列，原始序列經(jīng)過過濾低質(zhì)量和短長(zhǎng)度后得到717 887條優(yōu)化序列，最后經(jīng)過過濾嵌合體后用于后續(xù)分析的有645 813條序列，平均長(zhǎng)度為256 bp，其中癌組織(BC，n=6)共有300 222條有效序列；癌旁組織(PBC，n=6)共有345 591條有效序列。OUT聚類分析后，我們發(fā)現(xiàn)12例樣品2組共有7 642個(gè)OUT，其中骨癌組織有1 648個(gè)特有OUT，癌旁組織有1 895個(gè)特有OUT，剩下的4 102個(gè)OUT是2組共有的，說(shuō)明了大部分菌群為兩者共有，小部分特殊菌群為癌組織特有(圖1)。

表1 數(shù)據(jù)、數(shù)理統(tǒng)計(jì)及質(zhì)控

圖1 組間韋恩圖

2.2 癌組織與癌旁組織Alpha多樣性比較圖2是以97%的一致性進(jìn)行稀釋曲線的繪制，曲線趨于平緩，說(shuō)明本試驗(yàn)測(cè)序數(shù)據(jù)合理。由表2可知，對(duì)患犬癌組織(BC組)和癌旁組織(PBC組)的Alpha多樣性分析表明， Shannon、Simpson、Chao1、Ace指數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，Coverage指數(shù)(即樣本菌群覆蓋率)均高達(dá)98%。

圖2 稀釋曲線

表2 癌組織(BC)和癌旁組織(PBC)Alpha多樣性分析

2.3 癌組織與癌旁組織Beta多樣性比較使用主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis，PCoA)將多維數(shù)據(jù)降維，對(duì)樣本之間的物種多樣性關(guān)系進(jìn)行描述。如果樣本的物種豐度和構(gòu)成越相似，則其在PCoA圖中的距離越近。由圖3可知，癌組織菌群明顯聚集，且與癌旁組織菌群有一定的差異。

圖3 癌組織與癌旁組織菌群的PCoA分析

對(duì)于癌組織和癌旁組織細(xì)菌豐富排名前10的菌群進(jìn)行門水平分析，結(jié)果由圖4可知，2組分別有10個(gè)菌門，其中癌組織的優(yōu)勢(shì)菌門有變形菌門(Proteobacteria，39.09%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，14.21%)、厚壁菌門(Firmicutes，13.25%)、廣古菌門(Euryarchaeota，6.39%)和螺旋菌門(Spirochaetota，2.12%)；癌旁組織的優(yōu)勢(shì)菌門有變形菌門(Proteobacteria，52.35%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，9.99%)、厚壁菌門(Firmicutes，18.40%)和梭桿菌門(Fusobacteriota，1.85%)。由表4可知，癌組織的擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)以及螺旋菌門(Spirochaetota)顯著高于癌旁組織(P<0.05)，其脫硫菌門(Desulfobacterota)極顯著高于癌旁組織(P<0.01)。

A.不同樣本；B.不同組別

對(duì)于癌組織和癌旁組織細(xì)菌豐富排名前10的菌群進(jìn)行屬水平分析，結(jié)果由圖5可知，癌組織菌群優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度從高到低分別是：假單胞桿菌屬(Pseudomonas，2.56%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.49%)、鏈球菌屬(Streptococcus，1.83%)、埃希-志賀菌屬(Escherichia-Shigella，0.61%)；癌旁組織優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度從高到底分別是：假單胞桿菌屬(Pseudomonas，9.27%)、鏈球菌屬(Streptococcus，3.82%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，2.27%)、梭桿菌屬(Fusobacterium，1.49%)。由表5可知，癌組織的甲烷桿菌屬、互營(yíng)桿菌屬以及Sarcina屬顯著高于癌旁組織(P<0.05)，有趣的是癌旁組織中不含有Sarcina屬。

A.不同樣品；B.不同組別

表4 癌組織與癌旁組織菌群門水平豐度

表5 癌組織與癌旁組織菌群屬水平豐度

2.4 LDA差異貢獻(xiàn)分析LEfSe (LDA Effect Size)用于分析發(fā)現(xiàn)和解釋高維度生物標(biāo)識(shí)(基因、通路和分類單元)，比較2組的差異物種進(jìn)而尋找差異顯著的Biomarker[13]。利用LEfSe分析發(fā)現(xiàn)差異物種并通過LDA(線性判別分析)評(píng)估差異物種的影響影響程度，即得到LDA score。通過對(duì)BC-PBC的LEfSe分析，我們發(fā)現(xiàn)LDA score>4的biomarker共有27個(gè)，包括硝化螺旋菌屬(Nitrosococcaceae)、反芻甲烷桿菌(Methanobacterium)、擬桿菌門(Bacteroidota)、Exilispira、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、假單胞菌目(Pseudomonadales)等(圖6A)。其中，代表癌組織的紅色節(jié)點(diǎn)在以下4個(gè)進(jìn)化樹上是富集的(圖6B)，起到主要差異作用：(1)擬桿菌門(Bacteroidota)—擬桿菌綱(Bacteroidia)—擬桿菌目(Bacteroidales)—擬桿菌科(Williamwhitmaniaceae)；(2)廣古菌門(Euryarchaeota)—甲烷桿菌綱(Methanobacteria)—甲烷桿菌目(Methanobacteriales) —甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)；(3)螺旋菌門(Spirochaetota)—螺旋菌目(Brachyspirales)—螺旋菌科(Brachyspirae)—未分類的短螺旋體屬(Brachyspira)。代表癌旁組織的綠色節(jié)點(diǎn)在下一個(gè)進(jìn)化樹上是富集的(圖6B)：γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)—伯克氏菌目(Burkholderiales)/假單胞菌目(Pseudomonadales)—假單胞細(xì)菌科(Pseudomonadaceae)。無(wú)差異物種標(biāo)為黃色節(jié)點(diǎn)。

圖6 LDA值分布柱狀圖(A)和進(jìn)化分布圖(B)

2.5 功能預(yù)測(cè)根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果，選取每個(gè)分組最大豐度排名前10的功能信息，對(duì)患犬的癌組織和癌旁組織菌群進(jìn)行Tax4Fun功能分析，結(jié)果見圖7。由圖7A可知，2組菌群的功能相似，主要是代謝(metabolism)、基因信息處理(genetic information processing)和環(huán)境信息處理(environmental information processing)等，其中代謝通路和環(huán)境信息處理在功能豐度上具有極顯著性差異(P<0.01)。由圖7B可知，代謝功能主要包括碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、能量代謝(energy metabolism)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)、聚糖生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism)?；蛐畔⑻幚砉δ苤胸S度較高的有膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)；環(huán)境信息處理功能中豐度較高的有翻譯(translation)和復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)。根據(jù)組間t-test檢驗(yàn)，癌組織明顯升高的通路有翻譯(translation)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、能量代謝(energy metabolism)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、輔助因子和維生素的代謝(metabolism of cofactors and vitamins)等通路(P<0.05)；癌旁組織明顯升高的通路有膜轉(zhuǎn)運(yùn)(membrane transport)、復(fù)制與修復(fù)(replication and repair)、聚糖生物合成與代謝(glycan biosynthesis and metabolism)和脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)等通路(P<0.05)(圖7C)。

圖7 Tax4Fun功能注釋相對(duì)豐度柱形圖(A)和t-test組間差異分析(B和C)

3 討論

有研究證實(shí)了癌癥患者的癌組織中存在菌群，并進(jìn)行了大致描述，發(fā)現(xiàn)每個(gè)癌癥患者的癌組織都有其獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)，并與健康人群存在顯著性差異[8]。犬是常用于人癌癥研究的動(dòng)物模型[14]，其骨癌組織中是否含有菌群，這一問題在國(guó)際上尚未明晰。因此本研究通過高通量測(cè)序手段分析患骨癌犬的癌組織與癌旁組織菌群的特異性以及多樣性，這對(duì)研究微生物與犬疾病的關(guān)系有著重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

16S rRNA高通量基因測(cè)序方法常用于難以培養(yǎng)的微生物的直接鑒定分析，該方法已成為研究環(huán)境樣本中微生物群落組成結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵技術(shù)[15-16]。本研究利用該方法對(duì)患犬的癌組織和癌旁組織的菌群進(jìn)行全面的檢測(cè)。盡管OUT準(zhǔn)確度為3%就可以確定細(xì)菌的種分類水平， 但也存在物種數(shù)量被低估的可能性[17-18]，因此對(duì)16S rRNA基因V3-V4區(qū)的菌群組成進(jìn)行了鑒定，并基于3%OUT間隙而非種水平分析菌群是從門到屬分類水平的組成。另外，骨癌癌組織菌群可能受到環(huán)境或者其他因素的影響，故剔除一些含量較低的OUT，選取相對(duì)豐度較高的門和屬進(jìn)行組間比較分析。本試驗(yàn)結(jié)果表明，患犬的癌組織中存在菌群，其種類與癌旁組織相比無(wú)明顯變化，2組樣本在門水平的菌群主要是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)；在屬水平上主要是綠膿桿菌屬(Pseudomonas)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)，這些結(jié)果表明癌組織處的微環(huán)境對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和分布影響較小。我們發(fā)現(xiàn)癌組織與癌旁組織的Alpha多樣性并無(wú)明顯差別(P>0.05)，其菌群的高度相似表明了癌性病變處的微環(huán)境對(duì)菌群特征影響較小。而Beta多樣性則有明顯差異，在門水平上，癌組織的擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)、脫硫菌門(Desulfobacterota)以及螺旋菌門(Spirochaetota)相對(duì)豐度顯著高于癌旁組織(P<0.05)；在屬水平上，癌組織的甲烷桿菌屬、互營(yíng)桿菌屬以及八疊球菌屬相對(duì)豐度顯著增加。這些研究結(jié)果表明，這些菌門與菌屬可能與犬骨癌的發(fā)生有關(guān)。為了進(jìn)一步篩選出2組存在顯著性差異的特異性細(xì)菌，我們進(jìn)行了LDA差異貢獻(xiàn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組共有27個(gè)物種存在顯著性差異，其中影響力最大的5個(gè)物種有硝化螺旋菌屬(Nitrosococcaceae)、反芻甲烷桿菌(Methanobacterium)、擬桿菌門(Bacteroidota)、Exilispira和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)。

目前的數(shù)據(jù)雖然表明這些細(xì)菌與犬骨癌之間存在潛在聯(lián)系，但也不能夠排除上述菌屬在癌癥發(fā)生、發(fā)展中僅僅作為旁觀者存在的可能。它們?cè)谌前┌l(fā)生中的作用仍需進(jìn)一步研究。在胃腸道癌癥中發(fā)現(xiàn)，菌群組成發(fā)生改變，癌癥中增加的物種可以用作癌癥發(fā)現(xiàn)、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)后的生物標(biāo)記物。本研究表明，在犬骨癌中，癌性病變部位的菌群特征存在改變，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了具有促癌特性的細(xì)菌，它們?cè)谌前┲械淖饔糜写M(jìn)一步研究。