苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特3種藥物抗人五毛滴蟲(chóng)的作用效果

程一丹，張西臣，張洪波，李建華，宮鵬濤，王曉岑，李 新，張 楠

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062)

人五毛滴蟲(chóng)(Pentatrichomonashominis)是一種新發(fā)現(xiàn)的潛在人獸共患腸道原蟲(chóng)，臨床上可引起腹瀉、腹痛、食欲減退等癥狀[1]。人五毛滴蟲(chóng)感染呈世界性分布，感染宿主廣，可感染人、犬、貓、非人靈長(zhǎng)類及嚙齒類動(dòng)物等[1-5]。近年來(lái)ZHANG等[6]發(fā)現(xiàn)人五毛滴蟲(chóng)感染還與胃腸道癌有高度關(guān)聯(lián)性。因此，防治人五毛滴蟲(chóng)病已經(jīng)成為不容忽視的問(wèn)題。

臨床上對(duì)感染人五毛滴蟲(chóng)的患者常用口服甲硝唑[1]和替硝唑[7]的方法進(jìn)行治療，但其毒副作用較大且存在一定程度的耐藥性，因此尋找高效、低毒的抗人五毛滴蟲(chóng)新藥勢(shì)在必行。目前，已有研究報(bào)道蛇床子素在體外對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的殺傷作用[8]，未見(jiàn)硝唑尼特和苦參堿抗人五毛滴蟲(chóng)作用的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)選用苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特3種藥物分別在體內(nèi)和體外研究抗人五毛滴蟲(chóng)的作用效果，為尋找抗人五毛滴蟲(chóng)新的藥物防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株人五毛滴蟲(chóng)蟲(chóng)株(ATCC30000)由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，3～4周齡，雌性60只，購(gòu)于北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑苦參堿，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)，批號(hào)S31035；蛇床子素，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司(純度≥98%)，批號(hào)S26004；硝唑尼特，南雄陽(yáng)普醫(yī)療科技有限公司(純度≥99%)，批號(hào)210501。

1.4 人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體的體外純培養(yǎng)將凍存于液氮中的人五毛滴蟲(chóng)復(fù)蘇，參照CHAO等[9]的方法，應(yīng)用TYI-S-33培養(yǎng)基在37℃條件下無(wú)菌培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)將取1 mL 蟲(chóng)體加入新的培養(yǎng)管中，并加入新鮮培養(yǎng)基。

1.5 不同質(zhì)量濃度苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的體外殺傷作用待人五毛滴蟲(chóng)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將蟲(chóng)體濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。將40 g/L苦參堿溶液(溶劑為蒸餾水)、40 g/L蛇床子素溶液(溶劑為無(wú)水乙醇)、2 g/L的硝唑尼特溶液(溶劑為DMSO)，加入蟲(chóng)體中，設(shè)置空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組?？鄥A和蛇床子素終質(zhì)量濃度梯度為4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 g/L，硝唑尼特的終質(zhì)量濃度梯度分別為10.000，5.000，2.50，1.250，0.625 mg/L。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h分別對(duì)各培養(yǎng)管中蟲(chóng)體數(shù)量進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。

1.7 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特作用人五毛滴蟲(chóng)的透射電鏡觀察以苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特3種藥物的最適質(zhì)量濃度處理10 h后收集蟲(chóng)體進(jìn)行透射電鏡樣品制作，同時(shí)設(shè)立無(wú)藥物對(duì)照組。離心棄上清，用PBS洗滌3次，3 500 r/min離心10 min，去上清，2.5%戊二醛固定液加入沉淀固定1 h以上。將樣品送至吉林大學(xué)人獸共患病研究所電鏡室，進(jìn)行1%餓酸固定、脫水、超薄切片等制樣步驟。待樣品制備完成后置于HITACHI H-7650透射電境下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察。

1.8 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人工感染人五毛滴蟲(chóng)小鼠的體內(nèi)殺傷作用每只BALB/c小鼠經(jīng)口灌服人五毛滴蟲(chóng)1×106個(gè)。將感染成功的BALB/c小鼠，隨機(jī)分為11組，每組5只。第1～3組為硝唑尼特用藥組：用藥劑量分別為0.5，1.0，2.0 mg/kg；第4～6組為蛇床子素用藥組：用藥劑量分別為25.0，50.0，100.0 mg/kg；第7～9組為苦參堿用藥組：用藥劑量分別為25.0，50.0，100.0 mg/kg；第10組為感染不用藥組；第11組為不感染不用藥組。各組小鼠分別經(jīng)口灌服相應(yīng)劑量藥物，每天1次，連續(xù)灌服3 d。收取各組小鼠糞便并提取糞便基因組，參考人五毛滴蟲(chóng)18S rRNA 基因的特異性引物[10](Ph1:5′-ATGGCGAGTGGTGGAATA-3′,Ph2:5′-CCCAA-CTACGCTAAGGATT-3′；Th3:5′-TGTAAACG-ATGCCGACAGAG-3′,Th5:5′-CAACACTGA-AGCCAATGCGAGC-3′)，應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增以檢測(cè)藥物對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的殺傷作用。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的體外殺傷作用培養(yǎng)24 h后，苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特在不同質(zhì)量濃度作用下的人五毛滴蟲(chóng)密度見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3種藥物均能夠抑制人五毛滴蟲(chóng)的生長(zhǎng)繁殖，且隨著藥物質(zhì)量濃度的升高，對(duì)蟲(chóng)體生長(zhǎng)繁殖的抑制作用也出現(xiàn)相應(yīng)的增強(qiáng)。在藥物作用蟲(chóng)體24 h后，4 g/L苦參堿和10 mg/L硝唑尼特均可完全殺滅人五毛滴蟲(chóng)，4 g/L蛇床子素對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的殺傷作用可達(dá)到96.2%，光學(xué)顯微鏡下仍可看到活動(dòng)蟲(chóng)體。

表1 不同質(zhì)量濃度苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的體外殺傷作用

2.2 不同作用時(shí)間苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的體外殺傷作用以4 g/L苦參堿用藥2 h后，50%以上的蟲(chóng)體失去活力，12 h可殺死全部蟲(chóng)體(圖1A)。而4 g/L蛇床子素在作用8 h后，藥物組蟲(chóng)體數(shù)量減少不顯著，在24 h時(shí)不能殺死全部蟲(chóng)體(圖1B)，與同質(zhì)量濃度苦參堿相比，作用效果較差。10 mg/L硝唑尼特在作用18 h時(shí)，蟲(chóng)體全部死亡(圖1C),人五毛滴蟲(chóng)的死亡率隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

A.苦參堿處理組；B.蛇床子素處理組；C.硝唑尼特處理組

2.3 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特作用人五毛滴蟲(chóng)的透射電鏡觀察透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，人五毛滴蟲(chóng)經(jīng)4 g/L苦參堿處理后，滋養(yǎng)體腫脹，胞質(zhì)內(nèi)部分空泡化(圖2A)。由4 g/L蛇床子素處理的人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體結(jié)構(gòu)完整，核膜邊緣不清晰，胞質(zhì)內(nèi)容物稀疏，多聚核糖體解聚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒(圖2B)。經(jīng)10 mg/L硝唑尼特處理后，人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體胞質(zhì)內(nèi)空化，核膜、胞膜崩解(圖2C)。而對(duì)照組蟲(chóng)體橫切面外觀結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整(圖2D)。

A.苦參堿作用人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體10 h后的形態(tài)；B.蛇床子素作用人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體10 h后的形態(tài)；C.硝唑尼特作用人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體10 h后的形態(tài)；D.無(wú)藥物正常組人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體。N.細(xì)胞核；G.高爾基體；H.氫化體；C.肋；RF.波動(dòng)膜；AF.前鞭毛

2.4 苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特對(duì)人工感染人五毛滴蟲(chóng)小鼠的體內(nèi)殺傷作用經(jīng)口灌服人五毛滴蟲(chóng)滋養(yǎng)體后小鼠全部感染。經(jīng)硝唑尼特低劑量組0.50 mg/kg和蛇床子素低劑量組25.0 mg/kg進(jìn)行處理后，仍可擴(kuò)增到人五毛滴蟲(chóng)，糞便及腸道灌洗液鏡檢可見(jiàn)蟲(chóng)體。而經(jīng)硝唑尼特1.0,2.0 mg/kg劑量組、蛇床子素50.0,100.0 mg/kg劑量組和苦參堿25.0,50.0,100.0 mg/kg 劑量組治療后，PCR和鏡檢均未檢測(cè)到人五毛滴蟲(chóng)。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中硝唑尼特、苦參堿和蛇床子素的最低作用劑量分別為1.0，25.0,50.0 mg/kg(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.硝唑尼特0.5，1.0，2.0 mg/kg劑量組；4～6.蛇床子素25.0，50.0，100.0 mg/kg劑量組；7～9.苦參堿25.0，50.0，100.0 mg/kg劑量組；10.感染不用藥組； 11.不感染不用藥組；12.陽(yáng)性對(duì)照；13.陰性對(duì)照

3 討論

目前，臨床上針對(duì)毛滴蟲(chóng)病一般采用硝基咪唑類藥物進(jìn)行治療?？谷宋迕蜗x(chóng)病的藥物通常選用化學(xué)藥物，如甲硝唑和替硝唑。連續(xù)口服5 d劑量為60 mg/kg的甲硝唑[11]或連用口服14 d劑量為30 mg/kg的替硝唑[7]可治療貓人五毛滴蟲(chóng)病。但有報(bào)道顯示，在人五毛滴蟲(chóng)感染貓的病例中，口服甲硝唑治療效果不明顯，替換藥物為羅硝唑后糞便干燥恢復(fù)正常[12]，說(shuō)明甲硝唑表現(xiàn)出耐藥性的問(wèn)題。因此尋找高效、低毒的抗人五毛滴蟲(chóng)新藥勢(shì)在必行。

硝唑尼特是一種新的廣譜抗寄生蟲(chóng)藥物，在人醫(yī)上該藥獲準(zhǔn)用于治療幼兒和成人的賈第蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)感染[13]，但并未見(jiàn)臨床上應(yīng)用硝唑尼特治療感染人五毛滴蟲(chóng)患者的報(bào)道。有相關(guān)研究顯示，硝唑尼特對(duì)豬三毛滴蟲(chóng)和陰道毛滴蟲(chóng)有殺滅作用[14-15]，但并沒(méi)有對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的抑制效果進(jìn)行研究。孟瑩等[16]研究發(fā)現(xiàn)，硝唑尼特可殺滅豬三毛滴蟲(chóng)，在24 h 時(shí)其最小抑制質(zhì)量濃度為12.5 mg/L。本試驗(yàn)與其報(bào)道的作用效果類似，當(dāng)硝唑尼特用藥量為10 mg/L 時(shí)，在18 h可殺死全部蟲(chóng)體，殺蟲(chóng)效果顯著。

近年來(lái)，中草藥抗人五毛滴蟲(chóng)的研究取得了很大進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，5 g/L的白頭翁水浸膏組作用48 h可殺滅全部人五毛滴蟲(chóng)[16]；黃連、雞冠花、金蓮花和青蒿在最低有效質(zhì)量濃度分別為5，5，20，8 g/L時(shí)，均可殺滅人五毛滴蟲(chóng)[8]。以上藥物對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的作用效果均只進(jìn)行了體外試驗(yàn)，但體內(nèi)治療效果如何并沒(méi)有進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)就中草藥提取物苦參堿和蛇床子素對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的體內(nèi)外作用效果進(jìn)行研究。

苦參堿對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)和鴿毛滴蟲(chóng)都有著良好的抑制及殺滅作用[17-18]，但對(duì)人五毛滴蟲(chóng)的具體藥理作用及抑殺人五毛滴蟲(chóng)的作用程度研究尚不明確。趙瑞等[17]報(bào)道，苦參堿用量100～400 mg/L，對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)具有明顯的抑殺作用。而本試驗(yàn)中使用的苦參堿質(zhì)量濃度最小為0.25 g/L，對(duì)人五毛滴蟲(chóng)也有著顯著的抑殺作用，蟲(chóng)體死亡率接近50%。體內(nèi)試驗(yàn)中在苦參堿以25 mg/kg的劑量治療人工感染人五毛滴蟲(chóng)的小鼠后，經(jīng)腸道灌洗液、糞便鏡檢和巢式PCR擴(kuò)增確定已清除小鼠體內(nèi)蟲(chóng)體。

蛇床子作為常見(jiàn)中草藥，成本低廉，毒性低，有著廣闊的發(fā)展前景，其對(duì)鴿毛滴蟲(chóng)和陰道毛滴蟲(chóng)有很好的抑制效果[19-20]。陳海華等[19]發(fā)現(xiàn)蛇床子素在5 g/L時(shí)，12 h可殺滅全部鴿毛滴蟲(chóng)；蛇床子素對(duì)陰道毛滴蟲(chóng)的最低抑制質(zhì)量濃度為1.12 g/L[20]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在4 g/L質(zhì)量濃度的蛇床子素作用于人五毛滴蟲(chóng)24 h，殺蟲(chóng)率達(dá)到97.88%，其與李永秀等[8]的研究結(jié)果相似，其4 g/L質(zhì)量濃度組蛇床子素在體外試驗(yàn)中并不能完全殺滅人五毛滴蟲(chóng)，但有顯著的抑制作用。但李永秀等[8]并未進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，而在本試驗(yàn)的體內(nèi)試驗(yàn)中50 mg/kg劑量的蛇床子素有著良好的治療效果，PCR和鏡檢均未檢測(cè)到人五毛滴蟲(chóng)。

本研究采用透射電鏡技術(shù)對(duì)苦參堿和蛇床子素和硝唑尼特處理后的人五毛滴蟲(chóng)進(jìn)行觀察。對(duì)照組蟲(chóng)體橫切面外觀結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，與HONIGBERG 等[21]描述的人五毛滴蟲(chóng)結(jié)構(gòu)基本相同。而在苦參堿和蛇床子素處理后的人五毛滴蟲(chóng)，均表現(xiàn)出多聚核糖體解聚，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒的現(xiàn)象，這與閆艷等[22]所觀察到白頭翁體外抗陰道毛滴蟲(chóng)的透射電鏡結(jié)果相似。表明蟲(chóng)體的蛋白合成可能受到影響，胞核無(wú)法維持正常功能，進(jìn)一步影響蟲(chóng)體生長(zhǎng)繁殖。而硝唑尼特作用后的人五毛滴蟲(chóng)胞質(zhì)均從破損的細(xì)胞膜處溢出，與雙氫青蒿素作用后的陰道毛滴蟲(chóng)形態(tài)相似[23]，陰道毛滴蟲(chóng)的細(xì)胞膜破損與雙氫青蒿素作用于微絲有關(guān)，而人五毛滴蟲(chóng)細(xì)胞膜的破損可能與硝唑尼特作用于微絲有關(guān)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步深入研究苦參堿、蛇床子素和硝唑尼特防治人五毛滴蟲(chóng)病的臨床應(yīng)用提供了參考。