基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的CRISPR/Cas12a生物傳感系統(tǒng)用于HPV16 DNA雙信號檢測

章麗玲，劉瀏，鄭明秋，方文凱，劉達，唐宏武

（武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢 430072）

光學(xué)傳感和分析在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要作用，在眾多體外生物檢測方法中，發(fā)光生物檢測法因其方便的光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、高靈敏度和快速響應(yīng)而成為目前主要的分析工具［1～4］.傳統(tǒng)的發(fā)光探針，如有機染料［5～7］、量子點［8］和金銀納米簇等［9～11］，存在背景噪聲高、紫外及可見光引起的樣品光損傷、光漂白閾值低和潛在的毒性等缺點.基于鑭系離子獨特的化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)，稀土上轉(zhuǎn)換納米材料（UCNPs）具有穩(wěn)定性高［12，13］、細胞毒性低和對生物樣本幾乎沒有光損傷等優(yōu)點［14～17］.此外，UCNPs的單波長激發(fā)和多波長發(fā)射有利于多通路生物分子的測定，可以避免其它熒光的干擾，這些特性使摻雜Ln3+的UCNPs有望成為新一代發(fā)光生物探針.

在過去的幾十年中，已開發(fā)了多種基于Ln3+摻雜的UCNPs的新型高效生物分子測定技術(shù)，這些生物傳感系統(tǒng)的檢測機制主要通過發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（LRET）過程實現(xiàn)［18］.在典型的上轉(zhuǎn)換-發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移過程中，Ln3+摻雜的UCNPs受到近紅外光激發(fā)時，會以非輻射的方式將能量轉(zhuǎn)移給鄰近的光譜匹配受體（通常在10 nm或更小范圍內(nèi)），導(dǎo)致UCNPs的發(fā)光猝滅［19］.這些受體通常是可與UCNPs在峰值波長處發(fā)射匹配的吸收系數(shù)大的分子或納米材料，如熒光蛋白、有機染料、量子點、金納米顆粒或納米棒、二氧化錳納米片、石墨烯和石墨烯氧化物等［20～25］.自Wang等［26］在2005年首次報道上轉(zhuǎn)換-發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移過程以來，已經(jīng)開發(fā)了許多基于UC-LRET過程檢測生物分子的方法.

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（CRISPR）及其相關(guān)蛋白（CRISPR/Cas）系統(tǒng)是一種細菌用于抵抗外來遺傳物質(zhì)入侵的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，主要由Cas和CRISPR RNA（CrRNA）組成，該系統(tǒng)中Cas蛋白可以對入侵的外源DNA進行特異性切割，從而達到免疫效果［27］.Cas12a作為CRISPR/Cas系統(tǒng)的重要成員，通過識別PAM短序列的5′T，可以對dsDNA進行特異性切割（順式切割）；同時，Cas12a對ssDNA的切割（反式切割）活性也得到激發(fā)［28］，利用Cas12a的這種反式切割活性可實現(xiàn)對其它核酸分子的傳感檢測.本文首先在常規(guī)核UCNPs（C-UCNPs）基礎(chǔ)上合成了核/殼/殼內(nèi)殼層發(fā)光結(jié)構(gòu)UCNPs（CSS-UCNPs），可提高LERT效率（Scheme 1）.隨后，利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對ssDNA的反式切割活性，基于AuNPs比色和UCNPs發(fā)光檢測實現(xiàn)了對人乳頭瘤病毒DNA（HPV16 DNA）的雙信號靈敏檢測.當(dāng)目標(biāo)物HPV16 DNA不存在時，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)對Linker-ssDNA不發(fā)生切割，完整的Linker ssDNA可連接DNA-1/2-AuNPs，使二者發(fā)生團聚，溶液變?yōu)樗{紫色；當(dāng)目標(biāo)物HPV16 DNA存在時，可激活CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的反式切割活性，切割Linker ssDNA，此時DNA-1/2-AuNPs由于無法發(fā)生連接，保持分散狀態(tài)，溶液呈紅色，通過比色法可初步完成定性檢測；團聚程度不同的DNA-AuNPs在527 nm吸收強度不同，使其對UCNPs在542 nm發(fā)射峰的猝滅效果也不同，UCNPs的發(fā)光信號發(fā)生改變，通過聚乙烯亞胺（PEI）CSS-UNCPs發(fā)光信號的變化可以進一步實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的定量檢測，比色法與熒光法雙信號檢測的結(jié)合有效提高了對目標(biāo)分析物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.

Scheme 1 Schematic illustration of analysis procedure for dual signal detection of HPV16 DNA by CRISPR/Cas12a biosensor based on upconversion luminescent resonance energy transfer

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

YCl3·6H2O（純度99.99%）、YbCl3·6H2O（純度99.99%）、ErCl3·6H2O（純度99.99%）、十八烯（C18H36，純度95%）、油酸（C18H34O2，純度90%）（OA）、氟化銨（NH4F）、三水合氯化金（HAuCl4·3H2O）、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、二水合檸檬酸三鈉（Na?C?H?O?·2H?O）和聚乙烯亞胺（PEI，Mw=1800）均購自阿拉丁試劑公司；LbCas12a購自廣東博徠斯生物科技公司；其它分析純試劑均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗用超純水電阻率為18.25 MΩ·cm.所用DNA序列購自生工生物工程（上海）股份有限公司，具體序列信息見本文支持信息表S1.

FTIR5700型傅里葉紅外光譜分析儀（FTIR，美國Thermo公司）；XPert Pro型X射線衍射儀（XRD，荷蘭帕納科公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計（UV-Vis，日本Shimadzu公司）；F-4700型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；JEM-2100 Plus型200 kV高分辨透射電子顯微鏡和JEM-2100 F型200 kV高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM，日本JOEL公司）；Zetasizer Nano ZEN3600型動態(tài)光散射儀（DLS，日本Malvern公司）；HC-2518R型高速冷凍離心機（安徽中科中佳公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 上轉(zhuǎn)換納米材料的合成在文獻［29］報道的高溫共沉淀法的基礎(chǔ)上進行部分改進，通過介導(dǎo)殼層外延成長法合成核/殼/殼內(nèi)殼層發(fā)光的上轉(zhuǎn)換納米材料（CSS-UCNPs）.

向100 mL三頸燒瓶中加入1 mmol YCl3·6H2O、15 mL十八烯和6 mL油酸，攪拌混合后，將體系抽真空40 min；隨后，在氬氣保護下升溫至160℃，加熱40 min，白色固體完全溶解，得到淡黃色透明均相溶液；冷卻至室溫，緩慢勻速加入含有4 mmol NH4F和2.5 mmol NaOH的6 mL甲醇溶液，劇烈攪拌后形成白色渾濁液.隨后，加熱升溫至110℃，反應(yīng)30 min以去除體系中的甲醇，抽真空30 min以去除殘存的甲醇和水分子，在氬氣保護下快速升溫至310℃，反應(yīng)1 h后，向上述溶液加入20 mL乙醇，以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，所得白色沉淀經(jīng)體積分數(shù)50%的乙醇洗滌3次后，再使用正己烷/乙醇混合溶液（體積比1∶3）洗滌3次，得到核UCNPs（命名為C1-UCNPs）并分散在4 mL三氯甲烷溶液中，置于4℃冰箱中用于后續(xù)合成.

向100 mL三頸燒瓶中加入n（Y）/n（Yb）/n（Er）=0.80/0.18/0.02的0.75 mmol稀土鹽混合物、11.5 mL十八烯和4.5 mL油酸，將混合體系抽真空40 min；隨后，在氬氣保護下升溫至到160℃，加熱40 min至白色固體完全溶解，得到淡黃色透明均相溶液；冷卻至室溫，注射加入C1-UCNPs核（core），加熱至110℃，反應(yīng)30 min以去除體系中的氯仿，降至室溫后勻速緩慢加入含有3 mmol NH4F和1.8 mmol NaOH的5 mL甲醇溶液，劇烈攪拌，形成白色渾濁液.后續(xù)步驟與之前相同，最后得到核/殼UCNPs（命名為CS-UCNPs）并分散在4 mL三氯甲烷中，置于4℃冰箱中用于后續(xù)合成.

向50 mL三頸燒瓶中加入0.25 mmol YCl3·6H2O、7.5 mL十八烯和3 mL油酸，將混合體系于室溫抽真空40 min；隨后，在氬氣保護下升溫至160℃，加熱30 min至白色固體完全溶解，得到淡黃色透明均相溶液；冷卻至室溫，注射加入CS-UCNPs（core-shell），加熱至110℃，反應(yīng)30 min以去除體系中的氯仿，降至室溫后緩慢勻速加入含有1 mmol NH4F和0.63 mmol NaOH的5 mL甲醇溶液，劇烈攪拌，形成白色渾濁液.后續(xù)步驟與之前相同，最后得到核/殼/殼UCNPs（CSS-UCNPs）并分散在4 mL三氯甲烷中，置于4℃冰箱中待用.

在文獻［29］報道的高溫共沉淀法的基礎(chǔ)上進行部分改進，合成核發(fā)光UCNPs（C-UCNPs）的核層.向100 mL三頸燒瓶中加入n（Y）/n（Yb）/n（Er）=0.80/0.18/0.02的0.75 mmol稀土鹽混合物、11.5 mL十八烯和4.5 mL油酸，其它合成具體步驟與之前相同.

1.2.2 配體交換法合成PEI修飾的UCNPs采用配體交換法對C-UCNPs和CSS-UCNPs進行PEI修飾，合成了一系列PEI-UCNPs.首先，稱取300 mg PEI置于50 mL三口燒瓶中，加入20 mL一縮二乙二醇，常溫下攪拌至溶液均相澄清，抽真空30 min后，在氬氣保護下升溫至110°C；隨后，向體系內(nèi)注射加入4 mL UCNPs，反應(yīng)45 min以除去溶液中的氯仿；升溫至240°C并攪拌反應(yīng)5 h，加入20 mL無水乙醇使沉淀析出，用無水乙醇洗滌沉淀，以13000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)此操作4次，最后超聲分散至3 mL超純水中.

1.2.3 金納米顆粒（AuNPs）和DNA功能化金納米顆粒（DNA-AuNPs）的制備參照文獻［30］方法并稍作改進，采用檸檬酸還原法制備13 nm AuNPs.取1.03 mL濃度為25.4 mmol/L的HAuCl4水溶液置于100 mL燒瓶中，加入23.97 mL超純水，水浴加熱至130℃，持續(xù)沸騰15 min，隨后加入2.5 mL檸檬酸鈉（38.8 mmol/L），溶液逐漸變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱15 min后攪拌，冷卻至室溫，所得溶液避光置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?

采用經(jīng)典鹽化法制備DNA-AuNPs［31］.分別取120 μL DNA 1（20 μmol/L）和120 μL DNA 2（與TCEP在室溫孵育1 h）加入到800 μL AuNPs原液中，室溫下孵育24 h后，每隔20 min緩慢加入5 μL 2 mol/L NaCl溶液至NaCl終濃度為0.2 mol/L；室溫下孵育16 h后，用10 mmol/L的T-OAC緩沖液洗滌5次以除去剩余未反應(yīng)的DNA分子，最后分散至400 μL T-OAC緩沖液中，避光置于4℃冰箱中儲存?zhèn)溆?

1.2.4 HPV16 DNA的雙信號檢測HPV16 DNA的雙信號檢測分為比色檢測和熒光檢測.取0.6 mL無酶離心管分別加入2 μL LbCas12a蛋白（1 μmol/L）、3 μL CrRNA（1 μmol/L）和43.5 μL NEB CutSmart Buffer 2.1緩沖溶液，充分混勻，置于30℃搖床上振蕩孵育30 min，分別加入1 μL不同濃度的目標(biāo)雙鏈DNA與1.5 μL Linker DNA（10 μmol/L），于30℃搖床上振蕩孵育2 h，再分別加入50 μL DNA 1-AuNPs和DNA 2-AuNPs，于30℃搖床上振蕩孵育30 min后，通過肉眼進行比色；隨后分別加入20 μL預(yù)先制備的氨基功能化的CSS-UCNPs，于30℃搖床上振蕩孵育1 h后，用配有980 nm激光器的熒光儀測量上轉(zhuǎn)換熒光強度.

2 結(jié)果與討論

2.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的表征

Fig.1 Powder XRD patterns of C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs(B)

NaYF4基質(zhì)有2種常見晶型，一種為立方相（α），另一種為六方相（β）.據(jù)文獻［32］報道，六方相NaYF4的晶體結(jié)構(gòu)對稱性較低，而對稱性低的晶體場有利于發(fā)光離子的f-f躍遷，與立方相NaYF4相比，六方相NaYF4的發(fā)光效率可提高約1個數(shù)量級.因此，為了獲得高發(fā)光效率的UCNPs，首先利用高溫共沉淀法合成了2種不同結(jié)構(gòu)的六方相UCNPs（C-UCNPs和CSS-UCNPs），然后對這些UCNPs進行了XRD測試，用于確定基質(zhì)晶型結(jié)構(gòu).從粉末晶體衍射結(jié)果（圖1）可以看出，2種UCNPs晶型譜圖的晶體衍射峰與六方相NaYF4材料（JCPDs：28-1192）標(biāo)準(zhǔn)卡片的衍射峰完全一致，表明已合成純六方相基質(zhì)的2種UCNPs.

為了分析制備的C-UCNPs和CSS-UCNPs的形貌和尺寸，進行了TEM表征.從圖2（A）和圖3（A）～（C）可以看出，2種UCNPs均呈均勻的圓棒形.由圖3（A）可知，CSS-UCNPs的核C1-UCNPs呈圓棒形，軸向粒徑約為29.10 nm，徑向粒徑約為21.75 nm［圖3（G）和（J）］；然后通過高溫共沉淀、介導(dǎo)殼層外延成長法，以C1-UCNPs為種子，在其表面生長一層發(fā)光殼層，制得CS-UCNPs.如圖3（B）所示，CSUCNPs呈圓棒形，軸向粒徑約為38.91 nm，徑向粒徑約為22.85 nm［圖3（H）和（K）］.與C1-UCNPs比較可知，發(fā)光殼層主要生長在軸向，在軸向約生長4.9 nm；最后通過同樣的方法，以CS-UCNPs為種子，在CS-UCNPs表面生長一層惰性殼層，制得CSS-UCNPs.由圖3（C）可知，CSS-UCNPs呈圓棒形，軸向粒徑約為43.26 nm，徑向粒徑約為24.28 nm［圖3（I）和（L）］.與CS-UCNPs比較可知，惰性殼層也主要生長在軸向，軸向和徑向生長的差異性可能跟晶體的異向生長有關(guān).HRTEM［圖2（B）和圖3（D）～（F）］表明，C-UCNPs，C1-UCNPs，CS-UCNPs和CSS-UCNPs具有較清晰的晶格條紋，晶面間距約為0.52 nm，與六方相NaYF4的（100）晶面參數(shù)一致.通過HRTEM和XRD分析，進一步證明了合成的2種UCNPs均為六方晶相.

Fig.2 TEM(A)and HRTEM(B)images,axial(C)and radial(D)particle size statistics of C-UCNPs

為了獲得材料表面分子的官能團或化學(xué)鍵等信息，對制備的UCNPs進行了紅外光譜（FTIR）表征，驗證了UCNPs表面油酸分子的存在.如圖4所示，在C-UCNPs和CSS-UCNPs的紅外光譜圖中均檢測到1557和1464 cm-1處的2個鄰近吸收峰，歸屬于羧酸根離子的對稱和反對稱振動吸收峰.綜上，確定合成了油酸包覆的UCNPs.

為了進一步驗證C-UCNPS和CSS-UCNPS的元素組成，進行了能譜（EDS）表征.從C-UCNPS的EDS能譜圖［圖5（A）］可知，敏化劑Yb離子和激活劑Er離子均已摻雜到NaYF4基質(zhì)中，Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb的原子百分比分別為14.36%，70.91%，12.89%，0.12%和1.72%，從C-UCNPs的mapping元素圖（圖6）可知，Na，F(xiàn)，Y，Yb和Er元素均分布在C-UCNPs上.從CSS-UCNPS的EDS能譜圖［圖5（B）］可知，敏化劑Yb離子和激活劑Er離子均已摻雜到CS-UCNPs和CSS-UCNPs中，CS-UCNPs的Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb的原子百分比分別為13.48%，74.85%，10.64%，0.10%和0.92%，CSS-UCNPs的Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb的原子百分比分別為14.85%，70.97%，12.90%，0.41%和0.87%，從圖7的mapping元素圖中可看出，Na，F(xiàn)和Y元素均分布在C1-UCNPs上［圖7（A）］，Na，F(xiàn)，Y，Er和Yb元素均分布在CS-UCNPs［圖7（B）］和CSS-UCNPs［圖7（C）］上.

Fig.3 TEM(A—C)and HRTEM(D—F)images of C1-UCNPs(A,D),CS-UCNPs(B，E)and CSS-UCNPs(C,F),axial particle size statistics(G—I)and radial particle size statistics(J—L)of C1-UCNPs(G,J),CS-UCNPs(H,K)and CSS-UCNPs(I,L)

Fig.4 FTIR spectra of C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs((B)

Fig.5 EDS spectra of C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs(B)

Fig.6 EDS element mappings of C-UCNPs

Fig.7 EDS element mappings of C1-UCNPs(A),CS-UCNPs(B)and CSS-UCNPs(C)

2.2 表面修飾PEI分子的UCNPs的表征

PEI分子中含有氨基基團，帶正電.當(dāng)UCNPs表面修飾上PEI分子后表面配體和表面電勢會發(fā)生改變，因此利用FTIR和動態(tài)光散射（DLS）分別對合成的UCNPs進行表征，以判斷UCNPs表面是否修飾了親水性的PEI配體.未修飾PEI的UCNPs檢測到1562和1461 cm-1處的2個鄰近吸收峰［圖8（A）］，歸屬于羧酸根離子的對稱和反對稱振動吸收峰；zeta電勢圖表明未修飾PEI的UCNPs帶負電［圖8（B）］，這是因為未修飾PEI分子的UCNPs表面配體是油酸分子，含有羧基，帶負電；修飾PEI分子后，在1637 cm-1處出現(xiàn)了吸收峰［圖8（A）］，歸屬于氨基的彎曲振動，zeta電勢圖表明親水UCNPs明顯帶正電［圖8（B）］.結(jié)合上述分析可知，在UCNPs表面已修飾上了PEI分子.

Fig.8 FTIR spectra(A)and DLS zeta potential(B)of UCNPs

2.3 金納米顆粒(AuNPs)和DNA功能化金納米顆粒(DNA-AuNPs)的表征

采用文獻［30］報道的檸檬酸鈉還原法合成AuNPs，并通過TEM和紫外-可見分光光度計對其進行表征.如圖9（A）所示，制備的AuNPs尺寸較均一，分散性良好；粒子直徑約為12.9 nm［圖9（B）］；如圖9（C）所示，AuNPs在521 nm處吸收峰強度最大，證明已合成了13 nm的AuNPs，可用于后續(xù)實驗.

Fig.9 TEM image of AuNPs(A),particle size statistics of AuNPs(B),UV-Vis absorption spectra of AuNPs with different concentrations(C),standard curve of AuNPs absorbance and concentration(D),UV-Vis absorption spectra of AuNPs and DNA-AuNPs(E)and zeta potential diagram of AuNPs and DNA-AuNPs(F)

采用鹽化法實現(xiàn)了巰基DNA與AuNPs的共價偶聯(lián)，在AuNPs和巰基DNA偶聯(lián)過程中，DNA和AuNPs的濃度比對偶聯(lián)效率有較大影響，因此需要通過建立吸光度值（A）與AuNPs濃度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得AuNPs的濃度.如圖9（D）所示，將521 nm處的吸光度A對一系列已知的AuNPs濃度進行線性擬合，得到吸光度值A(chǔ)與AuNPs濃度的線性方程：A=0.2864cAuNPs-0.0841［圖9（B）］，通過代入該方程可計算出AuNPs的濃度；隨后控制ssDNA濃度，確保AuNPs與DNA的偶聯(lián)效率.參照文獻［33］報道的DNA和AuNPs濃度比并對其稍做調(diào)整制備了DNA-AuNPs，當(dāng)DNA修飾在AuNPs上后，AuNPs的紫外吸收峰出現(xiàn)紅移.此外，由于DNA分子含有磷酸基團使其帶有負電，與AuNPs共價鍵連接后，AuNPs的電勢會進一步降低.基于這些性質(zhì)，對DNA-AuNPs進行了紫外-可見吸收光譜及DLS電勢測試.如圖9（E）所示，與DNA偶聯(lián)后AuNPs的最大吸收波長發(fā)生紅移，由521 nm移動到527 nm；DLS電勢測試結(jié)果表明，與AuNPs相比，DNA-AuNPs電勢明顯變負［圖9（F）］.以上結(jié)果均與預(yù)期一致，表明制備了DNAAuNPs.

2.4 可行性分析

由圖10（A）可知，AuNPs的UV-Vis吸收光譜與UCNPs在542 nm處的發(fā)射峰有較大重疊；由圖10（B）可知，PEI-UCNPs帶正電，AuNPs帶負電，二者可通過靜電作用吸附到一起.綜上可知，當(dāng)PEI-UCNPs作為能量供體，AuNPs作為能量受體時，兩者滿足發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移條件，AuNPs可以有效猝滅PEI-UCNPs在542 nm處的綠光發(fā)射.

Fig.10 UV-Vis absorption spectra of AuNPs and luminescence spectra of UCNPs(A)and zeta potential diagram of AuNPs and UCNPs(B)

2.5 兩種發(fā)光結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換納米材料的比較

UCNPs修飾PEI配體的過程中，由于UCNPs會與環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生能量交換產(chǎn)生表面猝滅效應(yīng)而引起上轉(zhuǎn)換納米材料發(fā)光強度的變化，且不同結(jié)構(gòu)的UCNPs發(fā)光強度變化情況有所不同，為此分別測定了2種不同結(jié)構(gòu)UCNPs修飾PEI配體前后的發(fā)光光譜.由圖11可知，CSS-UCNPs的發(fā)光強度變化最小，說明通過惰性殼層包覆的策略可以有效避免表面猝滅效應(yīng)的產(chǎn)生，提高抗外界環(huán)境干擾的能力.

Fig.11 Luminescence spectra of PEI modified C-UCNPs(A)and CSS-UCNPs(B)

實驗中探究了不同結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換納米材料與DNA-AuNPs之間的LRET效率.從圖12（A）和（B）的TEM照片可看出，DNA-AuNPs較為均勻地分布在PEI-UCNPs上，表明在靜電作用力下，DNA-AuNPs可吸附在PEI-UCNPs周圍，進一步證明了本方法的可行性.從圖12（C）和（D）可知，2種PEI UCNPs的猝滅效率分別為57.9%和77.5%，PEI C-UCNPs的猝滅效率較低，這是因為發(fā)光裸核是一個幾十納米的實心發(fā)光圓棒體，實現(xiàn)大部分猝滅實心發(fā)光體的發(fā)光難度較大，而CSS-UCNPs為幾納米的發(fā)光層，因此PEI CSS-UCNPs猝滅程度比較高.綜上分析，最終選擇了PEI CSS-UCNPs.

Fig.12 TEM images(A,B)and LRET spectra(C,D)of PEI C-UCNPs,PEI CSS-UCNPs with DNA-AuNPs

2.6 雙信號檢測和特異性驗證

Fig.13 Photograph of colorimetric(A)and luminescence spectra(B)of this biosensor in the presence of HPV16 dsDNA(a,a),HPV16 TS DNA(b,b),HPV16 NTS DNA(c,c)and HPV18 dsDNA(d,d)

CRISPR-Cas12a（Cpf1）蛋白是RNA引導(dǎo)的酶，作為細菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組成部分可結(jié)合和切割DNA.CRISPR/Cas12a蛋白的切割活性有2種激活方式：第一種是在CrRNA的作用下可以特異性靶向識別包含原型間隔序列（PAM）的目標(biāo)雙鏈DNA（dsDNA），在順式切割序列特異性的目標(biāo)dsDNA之后，Cas12a蛋白對于單鏈DNA（ssDNA）的反式切割活性也被激活，可以無差別地切割其附近的任何ss DNA；第二種是在CrRNA的作用下可以特異性靶向識別不具有PAM序列的ssDNA，激活反式切割活性，非特異性切割任何非目標(biāo)ssDNA.本實驗選擇第一種激活方式，使用含有PAM序列的HPV16 dsDNA，激活CRISPR/Cas12a的切割活性，實現(xiàn)對Linker ssDNA的切割降解，從而通過體系顏色和光學(xué)信號的雙信號改變實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測.為了驗證這一核心觀點，首先使用HPV16 dsDNA，HPV18 dsDNA，HPV16 TS ssDNA和HPV16 NTS ssDNA作為檢測物，驗證CRISPR-Cas12a反式切割Linker ss DNA的活性.從圖13（A）中的顏色變化可以看出，CrRNA可特異性識別并結(jié)合HPV16 dsDNA和HPV16 TS ssDNA，進而激活CRISPR/Cas12a對Linker ssDNA的切割活性，這與CRISPR-Cas12a系統(tǒng)兩種激活方式相對應(yīng).由于Linker ssDNA斷裂，DNA-1/2-AuNPs無法發(fā)生連接，保持分散狀態(tài)，溶液呈現(xiàn)紅色；同時，CrRNA無法識別結(jié)合HPV18 dsDNA和HPV16 NTS ssDNA，不能激活CRISPR/Cas12a的切割活性，Linker ssDNA保持完整，DNA-1/2-AuNPs穩(wěn)定連接，使得AuNPs發(fā)生團聚，溶液變?yōu)樗{紫色.加入PEI CSS-UCNPs與上述體系混勻孵育1 h后，采集上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號，從圖13（B）可知，團聚程度不同的DNA-AuNPs對UCNPs在542 nm處的猝滅效果不同，分散狀態(tài)的AuNPs可明顯猝滅上轉(zhuǎn)換在542 nm處的發(fā)光.另外，相較于不具有PAM序列的ssDNA，具有PAM序列的dsDNA與CRISPR/Cas12a結(jié)合后激活的DNA切割活性更高，且dsDNA的NTS鏈有助于將Cas12a復(fù)合物穩(wěn)定在最佳構(gòu)象，進而實現(xiàn)對ssDNA的反式切割［28］.因此最終選擇HPV16 dsDNA作為目標(biāo)物激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性從而實現(xiàn)對Linker ssDNA的切割降解，產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號的改變實現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測.

Fig.14 Schematic diagram of colorimetric detection principle(A),photograph of colorimetric detection of different concentrations of HPV16 DNA(B),luminescence spectra of different concentrations of HPV16 DNA(C)and scatter diagram of luminescence with different concentrations of HPV16 DNA(D)The inset in(D)is the working curve between the logarithm of HPV16 DNA and normalized luminescence intensity.

由上述結(jié)果可知，HPV16 dsDNA可以激活CRISPR/Cas12a的切割活性進而實現(xiàn)對Linker ssDNA的切割降解，Linker ssDNA的完整性會影響DNA-AuNPs間的團聚狀態(tài)［圖14（A）］；通過檢測不同DNA-AuNPs間團聚狀態(tài)下的PEI CSS-UCNPs的發(fā)光信號，可建立發(fā)光信號與不同HPV 16 dsDNA濃度的關(guān)系，實現(xiàn)對HPV16 DNA的檢測.對實驗條件進行優(yōu)化（圖S1和圖S2，見本文支持信息）后，選擇100 nmol/L Linker DNA，30℃，T-OAC反應(yīng)緩沖液作為連接2種DNA-AuNPs的實驗條件；選擇NEB CutSmart Buffer 2.1反應(yīng)緩沖溶液，Cas12a∶CrRNA濃度比為1∶1.5，反應(yīng)時間2 h，反應(yīng)溫度30℃作為激活CRISPR-Cas12a系統(tǒng)切割能力的實驗條件.在上述反應(yīng)條件下，檢測了不同濃度的HPV16 dsDNA（0，0.5，1，1.5，2，3和4 nmol/L）.本文方法分為比色和上轉(zhuǎn)換雙信號檢測，首先可以通過觀察顏色初步判斷是否存在目標(biāo)物.手機拍照后，加入PEI CSS-UCNPs混勻孵育1 h，采集上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號進行定量檢測，進一步提高檢測準(zhǔn)確性和靈敏度.從圖14（B）中的顏色變化可以看出，當(dāng)HPV16 DNA的濃度從0向4 nmol/L逐漸增加時，溶液顏色發(fā)生明顯變化，由藍紫色逐漸向紫紅色過渡，直至最后變成紅色，初步完成目標(biāo)物的定性檢測.隨后，為了對HPV16 DNA進行定量檢測，繪制了以上溶液的上轉(zhuǎn)換發(fā)光譜圖［圖14（C）］，并用UCNPs 542 nm處的發(fā)光強度和目標(biāo)物濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［圖14（D）］，對其進行線性擬合.如圖14（E）所示，HPV16 dsDNA濃度的對數(shù)值與上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度線性相關(guān)，檢測范圍為0.5～4 nmol/L，根據(jù)檢出限的定義3σ/k（σ為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為工作曲線的斜率），可計算得出發(fā)光法的檢出限為69.8 pmol/L.

為了驗證該雙信號檢測方法對目標(biāo)物HPV16 DNA片段識別的特異性，選取了分別與目標(biāo)HPV16 DNA單堿基錯配、雙堿基錯配、三堿基錯配的DNA序列、HPV18 DNA和空白對照，所有DNA序列的濃度均為4 nmol/L，按照上述流程對這幾種DNA序列進行比色和發(fā)光檢測.如圖15（A）所示，HPV16 DNA和單堿基錯配分別呈現(xiàn)紅色和暗紅色，其余DNA片段均呈現(xiàn)藍紫色，表明特異性較好，通過肉眼可明顯區(qū)分目標(biāo)DNA和單堿基錯配的目標(biāo)DNA，可完成初步定性檢測；隨后加入UCNPs后采集發(fā)光信號繪制柱狀圖，如圖15（B）所示，HPV16 DNA的上轉(zhuǎn)換發(fā)光在542 nm處的發(fā)光強度最低，單堿基錯配的次之，其它DNA片段的發(fā)光強度均比較高.綜合上述分析可知，建立的HPV16 DNA雙信號檢測方法具有良好的特異性，并且可以實現(xiàn)單堿基錯配檢測，提高了DNA片段的容錯率.

Fig.15 Photographs of colorimetric detection of different DNA molecules(A)and specificity investigation toward different DNA molecules(B)a.HPV16；b.MT1；c.MT2；d.MT3；e.HPV18；f.blank.

3 結(jié)論

通過多步高溫共沉淀法合成了C-UCNPs和CSS-UCNPs，并對這些UCNPs的晶型、形貌、表面配體和發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效率進行了表征.結(jié)果表明，制備了表面猝滅效應(yīng)低、發(fā)光共振轉(zhuǎn)移效率較高的CSS-UCNPs.隨后，制備了形貌較為均勻的DNA功能化的AuNPs（DNA-AuNPs）.將氨基修飾的CSSUCNPs與CRISPR/Cas12a-AuNPs復(fù)合系統(tǒng)結(jié)合，基于AuNPs比色和上轉(zhuǎn)換發(fā)光雙信號靈敏檢測HPV16 DNA.通過肉眼觀察不同團聚程度AuNPs的顏色變化，可以實現(xiàn)對目標(biāo)物的初步即時檢測；又利用UCNPs發(fā)光信號的輸出，進一步實現(xiàn)對目標(biāo)DNA的定量檢測，檢出限為69.8 pmol/L，這說明雙信號檢測有效地提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.此外，該方法不僅特異性強，而且還能識別單堿基錯配的HPV16 DNA，提高了DNA片段的容錯率.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/20220412.