牛支原體檢測(cè)方法初探※

●梁月梅 楊 樂(lè) 吳翠蘭 彭 昊 李軍※※

（1.南寧市江南區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 廣西 南寧 530031；2.廣西益多樂(lè)生物科技有限公司 廣西 南寧 530007；3.廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西 南寧 530001）

牛支原體是柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬的成員，是一類缺乏細(xì)胞壁、能通過(guò)0.22 μm的孔徑的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基生長(zhǎng)的原核生物[1-2]。牛只感染支原體可引起牛肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、耳炎、眼結(jié)膜炎等多種疾病，其中肺炎和乳房炎對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的危害最為嚴(yán)重，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]。近年來(lái)，廣西部分地區(qū)將肉牛作為支持鄉(xiāng)村振興的發(fā)展產(chǎn)業(yè)，由于省內(nèi)肉牛資源缺乏，需要從省外引購(gòu)，因此，肉牛的頻繁貿(mào)易便引起牛支原體的傳播流行[7-9]。為了解肉牛貿(mào)易中牛支原體的流行狀況，本研究采用PCR和支原體分離的方法，對(duì)某肉牛場(chǎng)從省外引購(gòu)的肉牛進(jìn)行牛支原體檢測(cè)，以期了解跨省區(qū)引進(jìn)肉牛的牛支原體的感染情況，為牛支原體的綜合防治提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源2021年11月，從廣西某肉牛場(chǎng)采集牛鼻拭子60份。該批牛從省外引進(jìn)1周后陸續(xù)有牛發(fā)病，表現(xiàn)為體溫升高，可達(dá)41℃左右，呼吸急促，流鼻涕，部分牛只咳嗽。

1.1.2 主要試劑和儀器PPLO肉湯購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司；馬血清購(gòu)自廣東蕊特生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×TaqMasterMix （Dye）等購(gòu)自北京康為科技發(fā)展有限公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)為Bio-rad公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)采用吳翠蘭等[7]方法進(jìn)行合成引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 病料處理將采集的60份鼻拭子分別加入適量的PBS，然后各分為2份，1份用于病原增殖，1份用于PCR擴(kuò)增。

1.2.3 病原增殖加有PBS的鼻拭子利用0.45 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，加入適量PPLO培養(yǎng)液，置于含有5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)3～5 d后，再劃線接種于PPLO固體培養(yǎng)基表面，置于含有5% CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)3～5 d后觀察固體培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4 PCR擴(kuò)增按照細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)處理的鼻拭子提取DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括2×TaqMasterMix （Dye） 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 5 min；95℃變性30 s，退火 55℃ 40 s，72℃延伸50 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原增殖結(jié)果

經(jīng)培養(yǎng)3～5 d，PPLO液體培養(yǎng)基由紅色逐漸變黃色；PPLO平板上肉眼可見極小的針尖狀菌落，在低倍顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，呈典型的支原體“煎蛋樣”菌落，共分離出2株支原體（圖1）。

圖1 支原體菌落形態(tài)（4×）

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

60份鼻拭子采用PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有19份能擴(kuò)出相應(yīng)的目的條帶（圖2）。同時(shí)將上述分離出的2株支原體經(jīng)PCR檢測(cè)，也擴(kuò)出了相應(yīng)的目的條帶。

圖2 牛支原體PCR檢測(cè)電泳圖

綜合上述結(jié)果，從60份鼻拭子中共檢測(cè)出19份牛支原體，檢出率為31.67%（19/60）；同時(shí)從60份中鼻拭子中分離出2份，分離率為3.33%（2/60）。結(jié)果表明，PCR檢出率高于支原體分離率。

3 討論

本研究于2021年11月采集省外引購(gòu)的肉牛鼻拭子60份，從60份鼻拭子中共檢測(cè)出19份牛支原體，檢出率為31.67%（19/60）；同時(shí)從60份中鼻拭子中分離出2份，分離率為3.33%（2/60）。研究結(jié)果表明，PCR檢出率高于支原體的分離率。究其原因，第一，支原體培養(yǎng)條件要求比較苛刻，其培養(yǎng)基需要含豐富的血清蛋白、膽固醇和酵母浸液等成分，其中，血清主要提供膽固醇、脂肪酸和蛋白質(zhì)，酵母浸液提供核苷前體、維生素及刺激生長(zhǎng)的某些成分；第二，支原體沒(méi)有細(xì)胞壁，穩(wěn)定性較差[3]。因此，支原體分離難度較大、時(shí)間較長(zhǎng)，一般不作為牛支原體的快速診斷方法。

目前，牛支原體已遍布全球，成為危害牛產(chǎn)業(yè)的病原之一[10]。該場(chǎng)牛支原體的發(fā)生主要是受到長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激和環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致的。2021年11月廣西處在溫?zé)岬沫h(huán)境，而北方已經(jīng)處在寒冷天氣，溫度變化太大，再加上長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸，更易導(dǎo)致牛只患病。有文獻(xiàn)報(bào)道[3，11-12]，臨床健康犢牛購(gòu)入后1～7 d，鼻腔中可檢出牛支原體，多數(shù)牛在運(yùn)達(dá)目的地后1～2 周發(fā)病。更為嚴(yán)重的是，牛支原體常與化膿隱秘桿菌、多殺巴氏桿菌、溶血曼氏桿菌、牛呼吸道合胞體病毒等病原發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染，臨床癥狀相似，難以鑒別，從而使病情更加復(fù)雜，治療難度加大。因此，需要借助分子生物學(xué)方法鑒別。

目前還沒(méi)研制出有效預(yù)防牛支原體感染的疫苗，該病的控制主要是依賴于良好的生產(chǎn)管理配合病原檢測(cè)和有效的抗生素治療。首先，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)堅(jiān)持自繁自育、全進(jìn)全出的養(yǎng)殖模式，避免引種帶來(lái)的疾病問(wèn)題；其次，構(gòu)建完善的管理方案，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高引進(jìn)牛只自身抵抗力，降低運(yùn)輸對(duì)機(jī)體的應(yīng)激；再次，做好常規(guī)疫苗免疫接種工作，保證?？贵w水平達(dá)標(biāo)，保證牛養(yǎng)殖安全。