納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根生長及丹參酮積累的影響

李鉑，魏思敏，于金高，高璐，武宜，宋忠興

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083；2.國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系咸陽綜合試驗站，陜西 咸陽 712083；3.咸陽市中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 咸陽 712083）

甘西鼠尾草（Salvia przewalskii）又名甘肅丹參、紫丹參、紅秦艽［1］，根中富含脂溶性丹參酮類活性成分，功效與丹參（S.miltiorrhiza）相近，多作為民族藥和地方品種在四川、甘肅、云南等地替代丹參使用［2］。丹參酮是一類普遍存在于鼠尾草屬（Salvia）植物中的以類異戊二烯為基本骨架的二萜醌類化合物，具有抗氧化、治療心血管疾病、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等生理作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮生物合成過程受多種外源金屬離子的雙向調(diào)控，如銅［4］、鋅、錳［5］、鎘［6］、銀［7］等；編碼丹參酮生物合成關(guān)鍵酶的某些基因，如3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、柯巴基焦磷酸合成酶（Copalyl diphosphate synthase，CPS）等，通過響應(yīng)外源物質(zhì)的誘導(dǎo)，基因表達水平升高，最終導(dǎo)致丹參酮類成分的高效積累。

納米銀顆粒（Silver nanoparticles，AgNPs）具有高比表面積、粒徑微小、量子效應(yīng)顯著等特點，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、化妝品、食品、紡織品、藥物載體、水質(zhì)凈化等領(lǐng)域［8］。大多數(shù)AgNPs最終會進入土壤生態(tài)系統(tǒng)，進而被植物根系吸收，在生長水平、亞細(xì)胞水平和分子水平等多個維度與植物個體產(chǎn)生相互作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)，AgNPs對植物生長的影響由AgNPs濃度、粒徑大小、植物種類和作用時間等決定［10］；Ag-NPs暴露可誘導(dǎo)植物生成活性氧（ROS），進而對機體產(chǎn)生氧化脅迫［11］；AgNPs亦可能通過參與調(diào)節(jié)生長素、乙烯等植物激素的應(yīng)答進一步影響植物的生長發(fā)育［12］?；贏gNPs的諸多理化特征和生物學(xué)效應(yīng)，學(xué)者利用不同類型AgNPs處理黑麥草［13］、黃芪［14］、丹參［15］等植物，從植物生長特性、種子萌發(fā)規(guī)律、藥效成分生物合成等方面開展了相關(guān)研究，然而AgNPs調(diào)控藥用植物生長發(fā)育與次生代謝的生物學(xué)機制有待進一步深入探討。

甘西鼠尾草是中藥丹參的近緣種，丹參酮類成分次生代謝調(diào)控是分子生藥學(xué)領(lǐng)域的熱點問題之一［16］。因此，本研究利用基于超聲法制取的穿心蓮提取物納米銀顆粒，對甘西鼠尾草毛狀根進行脅迫處理，探究AgNPs對毛狀根生長及丹參酮合成與積累的影響。通過測定AgNPs脅迫下甘西鼠尾草毛狀根生物量，利用HPLC法測定毛狀根中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量水平，采用qRT-PCR法檢測AgNPs脅迫下丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因HMGR、DXR、CPS的相對表達水平，最終，從生長水平、藥效成分含量差異及關(guān)鍵酶基因表達水平，初步揭示納米銀顆粒對甘西鼠尾草毛狀根生長和藥效活性成分合成與積累的調(diào)控作用，為豐富丹參酮類化合物生物合成與代謝調(diào)控研究、合理開發(fā)和利用甘西鼠尾草提供一定的理論與實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

HYQ-240S型全溫雙層搖床（常州愛華儀器有限公司）；ME 204型萬分之一電子天平（Shimadzu，Japan）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；ZEN 3600型激光粒度儀（Malvern，UK）；美國Waters e2695高效液相色譜儀（串聯(lián)Waters 2998 PDA檢測器，自動進樣器，Breeze2色譜工作站）；NanoDrop OneC超微量核酸蛋白濃度檢測儀（Thermo Scientific，USA）；XRS+化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）；qTower實時熒光定量PCR儀（Analytik Jena，Germany）。

1.2 試驗材料與試劑

甘西鼠尾草毛狀根由本實驗室利用發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogeneATCC 15834侵染甘西鼠尾草無菌苗葉片獲得［17］。隱丹參酮（98%，批號：H02J11X107396）、丹參酮I（98%，批號：K04J12B136 345）、丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品（98%，批號：Y16M10C8848 7）購自上海源葉生物科技有限公司；色譜乙腈、甲醇（HoneyWell，USA）；SteadyPure植物RNA提取試劑 盒（AG21019）、Evo M-MLV反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（AG11705）、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（AG11718）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米銀顆粒制備

取穿心蓮干燥粉末2.5 g，加入50 mL ddH2O超聲4 h，得穿心蓮水提液；過濾，濾液加NaOH調(diào)節(jié)pH至10；將穿心蓮水提液與等量10 mM硝酸銀溶液混合，50℃超聲處理3 h；9 000 r/min離心30 min，收集沉淀，超純水沖洗3次，即得。

1.3.2 毛狀根培養(yǎng)與處理

取甘西鼠尾草毛狀根0.3 g，轉(zhuǎn)接至裝有50 mL 6，7-V液體培養(yǎng)基（含30 g/L蔗糖，pH 5.8）的錐形瓶中，置于搖床中避光培養(yǎng)21 d（25℃、120 r/min）。設(shè)置3個AgNPs處理濃度：吸取適量AgNPs母液加入培養(yǎng)基中，使其終濃度分別達到50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L，添加等體積無菌水作為對照（0 mg/L）；每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，處理7 d后測定毛狀根生物量和藥效成分含量。

1.3.3 毛狀根生物量測定

毛狀根處理結(jié)束后，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，濾紙吸干表面水分，精密稱量鮮重；隨后置于40℃烘箱中烘干至恒重，分別記錄干重。

1.3.4 樣品制備與丹參酮含量測定

精密稱定0.05 g甘西鼠尾草毛狀根粉末，加入8 mL 70%甲醇，靜置過夜；超聲處理30 min，靜置；取上清液，利用0.22 μm孔徑有機相微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。精密稱定隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇制成丹參酮混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（隱丹參酮5.45 μg/mL；丹參酮I，11.6 μg/mL；丹參酮IIA，12.4 μg/mL）。HPLC色譜柱：Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.02%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序參照文獻并做部分改動［18］：0～10 min，95%～80%A；10～15 min，80%～75%A；15～20 min，75%A；20～25 min，75%～80%A；25～28 min，80%～70%A；28～40 min，70%A；40～45 min，70%～55%A；45～50 min，55%～50%A；50～58 min，50%～42%A；58～67 min，42%～50%A；67～70 min，50%～40%A；70～80 min，40%～35%A；80～85 min，35%～0%A；85～95 min，0%～95%A，流 速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL；檢測波長270 nm。

1.3.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“1.3.4”中混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，分別注入液相色譜儀，以進樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)進行線性回歸分析，隱丹參酮：y=4 296 486.2x-13 908.8，r=0.999 8（保留 時 間63.813 min）；丹 參 酮I：y=5 342 189.7x-24 695.0，r=0.999 9（保留時間64.743 min）；丹參酮IIA：y=5 738 812.5x-17 996.7，r=0.999 9（保留時間76.810 min）?；鞓?biāo)溶液與樣品提取液HPLC色譜圖見圖1。

圖1 丹參酮類成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram profile of tanshinone components

1.3.6 毛狀根總RNA提取

分別在100 mg/L AgNPs處理毛狀根0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和7 d時取樣，蒸餾水沖洗3次，無菌濾紙吸干水分，錫箔紙包裹后投入液氮速凍，保存于-80°C冰箱待用；采用SteadyPure植物RNA提取試劑盒提取毛狀根總RNA，并檢測RNA濃度與質(zhì)量。

1.3.7 基因表達水平檢測

利用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得毛狀根cDNA，反應(yīng)體系：5×Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL，總RNA 1 μL，RNase free ddH2O 7 μL；反應(yīng)條件：37℃，15 min；85℃，15 s；4℃，∞。利用Primer Premier6.0軟件，針對丹參UBQ、HMGR、DXR、CPS基因序列設(shè)計qRT-PCR引物，引物序列見表1。采用SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒檢測上述基因相對表達水平，反應(yīng)體系：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，正反引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase free ddH2O 8.2 μL；反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃，30 s；變性：95℃，5 s；退火/延伸：60℃，30 s；40次循環(huán)。以丹參UBQ基因作為內(nèi)參基因，以未添加AgNPs毛狀根作對照，利用2-△△ct法計算不同處理時間各個基因的相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time quantitative reverse transcription PCR

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0軟件中Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析，利用Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNPs表征

激光粒度儀測定結(jié)果顯示：穿心蓮水提液超聲制備的納米銀顆粒平均粒徑為46.55 nm，粒度分布均勻，溶液均一穩(wěn)定，可用于后續(xù)脅迫處理。

2.2 納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根生長的影響

2.2.1 形態(tài)變化

如圖2所示，對照組（0 mg/L）甘西鼠尾草毛狀根外觀呈淺黃褐色，生長旺盛，質(zhì)地柔軟且含水量大；隨著外源AgNPs處理濃度增加，毛狀根色澤逐漸加深，100 mg/L AgNPs處理的毛狀根表面呈深棕褐色，與對照組相比生長狀況較差，表現(xiàn)出較明顯的脅迫特征。

圖2 不同濃度納米銀脅迫處理甘西鼠尾草毛狀根形態(tài)比較Fig.2 Morphology comparison of S.przewalskii hairy roots under different concentrations of AgNPs stress

2.2.2 鮮重和干重

由表2可知，納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根的生長總體表現(xiàn)為抑制作用。毛狀根鮮重以75 mg/L AgNPs處理的抑制效果最為顯著，相比對照組降低32.98%（P＜0.05）；不同濃度AgNPs處理毛狀根干重相比對照組則無顯著變化。同時，毛狀根含水量在添加納米銀顆粒后下降明顯，其中100 mg/L AgNPs處理使毛狀根含水量顯著下降，相比對照組降低2.36%（P＜0.05）?？傮w而言，納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根生物量積累具有一定的抑制作用。

表2 不同濃度納米銀脅迫處理甘西鼠尾草毛狀根生物量比較Tab.2 Biomass comparison of S.przewalskii hairy roots under different concentrations of AgNPs stress

2.3 納米銀脅迫對3種丹參酮類成分積累的影響

不同濃度納米銀脅迫處理7 d后，甘西鼠尾草毛狀根隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量變化如圖3所示，隨著AgNPs濃度的增加，丹參酮類成分含量均呈上升趨勢。50 mg/L AgNPs脅迫處理毛狀根7 d，隱丹參酮含量相比對照組（0 mg/L）顯著上升（P＜0.05），隨著AgNPs處理濃度的增加，隱丹參酮一直保持在較高水平；100 mg/L AgNPs處理的毛狀根中隱丹參酮積累速率放緩，含量達到1.375 mg/g DW，是對照組的16.01倍（P＜0.05）。丹參酮I在甘西鼠尾草毛狀根中含量總體處于較低水平，外源AgNPs脅迫對丹參酮I積累的促進作用明顯，100 mg/L AgNPs處理7 d后毛狀根中丹參酮I可達（0.098±0.008）mg/g DW，顯著高于對照組。毛狀根中丹參酮IIA的積累受到外源納米銀脅迫的顯著誘導(dǎo)，隨著AgNPs濃度的升高，處理組丹參酮IIA的含量分別為對照組的4.241倍、5.13倍、6.55倍（P＜0.05），以100 mg/L AgNPs的促進作用最為明顯。丹參酮類化合物是甘西鼠尾草主要藥效成分之一，綜合甘西鼠尾草毛狀根生長狀況和丹參酮類成分積累的差異性，旨在以獲取大量丹參酮類化合物為主要目的，故選擇100 mg/L作為納米銀脅迫濃度進行丹參酮生物合成關(guān)鍵酶基因表達水平分析。

圖3 不同濃度納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根丹參酮類成分的影響Fig.3 Effects of different concentrations of AgNPs stress on tanshinone accumulation in S.przewalskii hairy roots

2.4 納米銀脅迫對丹參酮生物合成途徑基因表達水平的影響

2.4.1 RNA提取結(jié)果

經(jīng)100 mg/L AgNPs脅迫處理不同時間的甘西鼠尾草毛狀根總RNA提取結(jié)果如圖4所示，總RNA條帶單一、完整、清晰，能夠滿足后續(xù)基因表達水平分析研究。

圖4 甘西鼠尾草毛狀根總RNA電泳圖Fig.4 Electrophoresis diagram of total RNA in S.przewalskii hairy root

2.4.2 基因表達水平影響

如圖5所示，甘西鼠尾草毛狀根HMGR基因相對表達量隨著納米銀脅迫時間的增加表現(xiàn)為先升后降，整體變化趨勢呈倒“V”字形。100 mg/L AgNPs脅迫處理初期，HMGR基因表達水平逐步上升，相對表達量均顯著高于對照組；100 mg/L納米銀脅迫處理24 h時會強烈誘導(dǎo)HMGR基因的高表達，相對表達水平為對照組的22.97倍（P＜0.01）；處理7 d時HMGR基因表達水平相較于其它處理時間有所降低，但仍顯著高于對照組，是對照組的4.21倍（P＜0.01）。

圖5 納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根HMGR基因表達水平的影響Fig.5 Effect of AgNPs stress on HMGR expression levels in S.przewalskii hairy roots

如圖6所示，甘西鼠尾草毛狀根DXR基因在受到納米銀脅迫處理期間，相對表達水平的變化趨勢與HMGR基本一致。100 mg/L AgNPs脅迫處理前期，DXR相對表達水平隨著處理時間的增加逐漸升高；AgNPs處理24 h時DXR基因相對表達水平達到最大值，是對照組的20.88倍（P＜0.01）；隨后DXR相對表達水平迅速回落，在脅迫處理末期達到最低值，但仍顯著高于對照組。

圖6 納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根DXR基因表達水平的影響Fig.6 Effect of AgNPs stress on DXR expression levels in S.przewalskii hairy roots

如圖7所示，100 mg/L納米銀脅迫處理甘西鼠尾草毛狀根時，CPS基因表達水平總體表現(xiàn)為“升高-降低-再升高-再降低”趨勢。100 mg/L AgNPs處理毛狀根6 h，CPS基因相對表達水平是對照組的3.24倍（P＜0.05），隨后出現(xiàn)略微下降；在納米銀顆粒處理24 h時，CPS基因相對表達量達到最高水平，顯著高于對照組（P＜0.01），與100 mg/L AgNPs脅迫誘導(dǎo)下HMGR、DXR基因表達水平的變化規(guī)律一致。在AgNPs處理后期，CPS表達水平相比脅迫處理24h時有所下降，依然保持在較高水平。

圖7 納米銀脅迫對甘西鼠尾草毛狀根CPS基因表達水平的影響Fig.7 Effect of AgNPs stress on CPS expression levels in S.przewalskii hairy roots

3 討論

研究表明，AgNPs可釋放出少量Ag+，對植物的生態(tài)毒理作用可能由其獨特的物理化學(xué)表面特性和游離的Ag+共同起作用［10，20］，也有學(xué)者提出AgNPs誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生氧化脅迫不依賴于其釋放出的Ag+［11］。王榮等［13］發(fā)現(xiàn)低濃度Ag+能促進黑麥草生長，高濃度銀脅迫下黑麥草生物量下降，根系長度減小，并且AgNPs對黑麥草根系的抑制作用強于同濃度Ag+，揭示納米銀粒徑小、比表面活性高等特征與其植物毒害作用的關(guān)聯(lián)性；Li等［7］利用Ag+處理絨毛鼠尾草毛狀根，發(fā)現(xiàn)低濃度Ag+一定程度促進毛狀根生長，隨著Ag+濃度提高，毛狀根生長受到顯著抑制；徐蓉蓉等［14］利用高濃度AgNPs處理蒙古黃芪種子后，種子發(fā)芽率顯著降低，平均發(fā)芽時間延長，幼苗胚根長、子葉大小等指標(biāo)均受到抑制。因此，高濃度納米銀的對植物毒害作用更為明顯。本研究中，納米銀顆粒顯著抑制甘西鼠尾草毛狀根生長，高濃度AgNPs脅迫下毛狀根鮮重和含水量下降明顯，說明AgNPs的大量積累對毛狀根可能產(chǎn)生一定的毒害作用。同時，我們觀測到毛狀根表面顏色隨AgNPs濃度的增加呈深棕褐色，一方面可能由于AgNPs的毒害作用導(dǎo)致細(xì)胞積累大量活性氧，毛狀根表皮細(xì)胞受損；另一方面，組織化學(xué)定位［21］和拉曼光譜顯示［22］，丹參酮類成分主要集中在丹參根周皮中，是丹參藥材呈現(xiàn)磚紅至紅棕色的主要因素；甘西鼠尾草與丹參根的形態(tài)相似，故毛狀根顏色加深可能也是丹參酮類化合物大量積累的直觀體現(xiàn)。AgNPs抑制甘西鼠尾草毛狀根生長并產(chǎn)生毒害作用的機制還需進一步研究。

Ma等［15］利用30 mg/Lβ-環(huán)糊精包被的AgNPs處理丹參毛狀根7 d，總丹參酮含量顯著上升，丹參酮生物合成途徑HMGR、DXR、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）基因、CPS等關(guān)鍵酶基因的表達水平上調(diào)明顯，多種抗氧化酶活性升高；然而在添加活性氧清除劑Vc后，上述基因表達水平受到明顯抑制，說明ROS在AgNPs脅迫調(diào)控丹參酮生物合成過程可能發(fā)揮重要作用。本研究中，外源AgNPs脅迫處理導(dǎo)致甘西鼠尾草毛狀根中隱丹參酮、丹參酮IIA大量積累，丹參酮I從痕量提高到（0.098±0.008）mg/g DW，以100 mg/L AgNPs的促進作用最為顯著，丹參酮生源合成關(guān)鍵酶HMGR、DXR、CPS基因均高表達，與前人研究結(jié)果基本一致。HMGR、DXR分別作為萜類化合物生物合成MVA途徑和MEP途徑的兩個關(guān)鍵酶，其表達水平?jīng)Q定多種次生代謝產(chǎn)物的含量；CPS催化牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸生成柯巴基焦磷酸，是二萜醌類丹參酮生物合成途徑中游的關(guān)鍵酶之一［16］。

本研究初步證實了AgNPs對甘西鼠尾草丹參酮積累及其生源合成相關(guān)酶基因的正調(diào)控作用，對于利用AgNPs提高丹參酮類化合物產(chǎn)量具有一定的指導(dǎo)作用，有助于促進甘西鼠尾草這一資源型藥用植物的高值化利用。后續(xù)將進一步探究AgNPs脅迫與機體ROS動態(tài)平衡、轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的關(guān)系，從分子水平闡明AgNPs參與調(diào)控丹參酮類活性成分生物合成的生物學(xué)機制。