飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉生長性能、氮代謝、血清生化指標(biāo)及糞便菌群的影響

白銀龍 牛一兵* 張海華 鞏文洋 曲毅程 龍 娟 王夕國 鞏元芳 趙惠媛 李素芬** 馮敏山,3**

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島 066004；2.秦皇島市三晶新農(nóng)飼料有限公司，昌黎 066600；3.河北省碣石皮毛產(chǎn)業(yè)研究院，昌黎 066600)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動(dòng)物腸道中的共生乳酸菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸和抑菌能力[1]，作為抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖中具有廣泛的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌可以提高斷奶仔豬生長性能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，維持腸道菌群平衡，且以5×108～1×1010CFU/kg添加水平效果較好[2-4]。糞腸球菌對育成期藍(lán)狐[5]和生長期水貂[6]也能起到提高生長性能和營養(yǎng)物質(zhì)消化率以及減少氮排放的作用，且以1×108CFU/kg添加水平效果較理想。益生菌通常被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)腸道菌群促進(jìn)動(dòng)物生長和健康，但益生菌對動(dòng)物的使用效果不僅與菌株和添加水平有關(guān)，還受到動(dòng)物本身固有的腸道菌群組成的影響[7]。烏蘇里貉屬雜食性毛皮動(dòng)物，研究發(fā)現(xiàn)采食相同飼糧的烏蘇里貉與藍(lán)狐糞便菌群組成和相對豐度有顯著差異[8]。但是，至今尚未見到糞腸球菌對烏蘇里貉生長性能及腸道菌群影響的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加不同水平糞腸球菌對生長期烏蘇里貉生長性能、氮代謝、血清生化指標(biāo)及糞便菌群的影響，以確定其適量添加水平，并探討糞腸球菌與腸道菌群和貉健康的關(guān)系，為其在貉養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)糞腸球菌

試驗(yàn)用糞腸球菌購自山東某生物工程股份有限公司，其有效活菌數(shù)量≥1×1010CFU/g。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物為健康、體重[(2.44±0.24) kg]相近的70日齡烏蘇里貉公貉。由于目前我國沒有統(tǒng)一的烏蘇里貉飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，因此參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[9]配制粗蛋白質(zhì)水平為22%的生長期貉基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as fed-basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items含量Content賴氨酸Lys1.58蛋氨酸Met0.61蘇氨酸Thr0.85鈣Ca0.97總磷TP0.78

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，糞腸球菌添加水平分別為0(對照組)、1×108(Ⅰ組)、1×109(Ⅱ組)和1×1010CFU/kg(Ⅲ組)。

將40只公貉隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10只，單籠飼養(yǎng)，每籠為1個(gè)重復(fù)。對照組飼喂不添加糞腸球菌的基礎(chǔ)飼糧，其他3組分別飼喂按上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加糞腸球菌的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)預(yù)試期7 d，正試期70 d。試驗(yàn)在河北科技師范學(xué)院動(dòng)物養(yǎng)殖試驗(yàn)場進(jìn)行。

試驗(yàn)期間，以貉自由采食為原則，每天按只稱料，以料∶水為1∶3加水?dāng)嚢杈鶆蚝?，每?8：00、15：00飼喂2次，自由飲水，采用自然光照。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱重，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.2.2 樣品采集和制備

基礎(chǔ)飼糧配制現(xiàn)場采樣，放入自封袋中備測。于112日齡采用全收糞法進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)。每天在尿桶中加入20 mL 10%鹽酸固氮，用量筒量取尿液體積，按1/20收集3 d的尿液，-20 ℃凍存。每天收集的糞便按鮮重的10%加入10%鹽酸溶液進(jìn)行固氮，80 ℃下殺菌2 h，再在65 ℃烘干至恒重，制備風(fēng)干樣品。

在消化代謝試驗(yàn)結(jié)束后次日晨飼前2 h采集新鮮糞便。參照陳雙雙[10]報(bào)道的收糞方法，待貉排出糞便后立即用無菌分裝袋收集，防止落地被污染。將2只貉的糞便混合后作為1個(gè)樣品，放入3 mL滅菌管中，液氮速凍，-80 ℃凍存，以備進(jìn)行菌群分析。為探討糞腸球菌是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群促進(jìn)動(dòng)物生長和健康，綜合各組生長性能、氮代謝和血清生化指標(biāo)，選擇上述指標(biāo)表現(xiàn)最好的Ⅰ組和對照組貉糞樣送檢。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，后肢靜脈采血5 mL，4 000 r/min離心10 min制備血清，-20 ℃保存，以備分析血清生化指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)測定及分析

飼糧、糞樣和尿樣中粗蛋白質(zhì)含量的測定參照GB/T 6432—2018凱氏定氮法。

采用日立7600全自動(dòng)生化儀測定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量，試劑購自南京建成生物工程研究所。

糞便總DNA的提取、16s rDNA V3～V4區(qū)擴(kuò)增、測序文庫構(gòu)建及Illumina NovaSeq平臺(tái)高通量測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。利用Illumina NovaSeq 6000系統(tǒng)對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行alpha多樣性和菌群分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12軟件中的ANOVA過程對所有生長性能、氮代謝和血清生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，方差分析差異顯著者，以LSD法比較平均值間的差異顯著性。采用t檢驗(yàn)比較對照組和Ⅰ組之間糞便菌群結(jié)構(gòu)的差異顯著性。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉生長性能的影響

由表2可知，Ⅰ組和Ⅱ組生長期烏蘇里貉平均日增重顯著高于對照組和Ⅲ組(P<0.05)，且Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ組和Ⅱ組料重比顯著低于對照組和Ⅲ組(P<0.05)；Ⅲ組上述2項(xiàng)指標(biāo)與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉平均日采食量無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉生長性能的影響Table 2 Effects of dietary Enterococcus faecalis on growth performance of growing Ussuri raccoon dogs

2.2 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉氮代謝的影響

由表3可知，與對照組相比，3個(gè)糞腸球菌添加組氮沉積量顯著提高(P<0.05)，但3個(gè)糞腸球菌添加組之間無顯著差異(P>0.05)；Ⅰ組和Ⅱ組蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值顯著提高(P<0.05)，Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)。飼糧添加糞腸球菌對粗蛋白質(zhì)消化率和凈蛋白質(zhì)利用率無顯著影響(P>0.05)。

2.3 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對照組相比，Ⅰ組和Ⅱ組生長期烏蘇里貉血清ALB含量顯著提高(P<0.05)，Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)；3個(gè)糞腸球菌添加組血清UN含量均顯著提高(P<0.05)。飼糧添加糞腸球菌對其他血清生化指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

2.4 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉糞便菌群的影響

由表5可知，與對照組相比，Ⅰ組生長期烏蘇里貉糞便菌群ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著提高(P<0.05)，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。由表6可知，生長期烏蘇里貉糞便菌群相對豐度在1%以上的門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門；與對照組相比，Ⅰ組擬桿菌門相對豐度顯著提高(P<0.05)，其他3個(gè)門相對豐度無顯著差異(P>0.05)。由表7可知，生長期烏蘇里貉糞便菌群屬水平的優(yōu)勢菌群為普雷沃氏菌屬、糞桿菌屬、光岡菌屬、Catenisphaera和小桿菌屬等；與對照組相比，Ⅰ組巨球型菌屬相對豐度顯著提高(P<0.05)，小桿菌屬、Catenisphaera和光岡菌屬相對豐度顯著降低(P<0.05)。

表3 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉氮代謝的影響Table 3 Effects of dietary Enterococcus faecalis on nitrogen metabolism of growing Ussuri raccoon dogs

表4 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary Enterococcus faecalis on serum biochemical indices of growing Ussuri raccoon dogs

表5 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉糞便菌群物種多樣性的影響Table 5 Effects of dietary Enterococcus faecalis on species diversity of fecal microbiota of growing Ussuri raccoon dogs

表6 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉糞便優(yōu)勢菌群門水平相對豐度的影響Table 6 Effects of dietary Enterococcus faecalis on relative abundance of fecal dominant microbiota at phylum level of growing Ussuri raccoon dogs %

表7 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉糞便優(yōu)勢菌群屬水平相對豐度的影響Table 7 Effects of dietary Enterococcus faecalis on relative abundance of fecal dominant microbiota at genus level of growing Ussuri raccoon dogs %

3 討 論

3.1 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉生長性能的影響

糞腸球菌對斷奶仔豬生長性能的影響并不一致。一些研究表明，糞腸球菌可以改善斷奶仔豬生長性能[11]，其他研究則認(rèn)為沒有影響仔豬生長性能指標(biāo)[12]。這些差異可能是由于糞腸球菌的菌株和添加水平不同。研究表明，育成期藍(lán)狐[5]和生長期水貂[6]飼糧中均以添加1×108CFU/kg糞腸球菌時(shí)生長性能最高，繼續(xù)提高糞腸球菌添加水平，生長性能并未進(jìn)一步提高，反而有所降低。本試驗(yàn)中，以飼糧添加1×108CFU/kg糞腸球菌時(shí)貉的生長性能指標(biāo)表現(xiàn)最好，過量添加則可能破壞了腸道菌群平衡。

3.2 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉氮代謝的影響

糞腸球菌能夠提高飼糧中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和能量的消化率[3]，凈蛋白質(zhì)利用率也得到提高[5-6]。有研究表明，乳酸菌參與機(jī)體包括膽汁酸的肝腸循環(huán)、脂類的吸收、糖異生和蛋白質(zhì)合成[13]。本試驗(yàn)中，3個(gè)糞腸球菌添加組粗蛋白質(zhì)消化率雖未顯著提高，但尿氮排泄量趨于降低，氮沉積量和蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值升高，說明糞腸球菌促進(jìn)了貉體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和利用。

3.3 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉血清生化指標(biāo)的影響

目前，關(guān)于糞腸球菌對血清生化指標(biāo)影響的報(bào)道不多。糞腸球菌使哺乳仔豬血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)含量顯著升高，但對血清UN含量無顯著影響[14]；糞腸球菌使生長豬血清肌酐含量降低，對血清GLU、UN和TC含量也無顯著影響[2]。本試驗(yàn)中，與對照組相比，Ⅰ組和Ⅱ組血清ALB含量提高，反映了機(jī)體合成蛋白質(zhì)的能力增強(qiáng)，這與本試驗(yàn)中2組氮沉積量提高的結(jié)果相一致；3個(gè)糞腸球菌添加組血清UN含量提高，可能與其采食量提高，導(dǎo)致食入氮量增加有關(guān)。

3.4 飼糧添加糞腸球菌對生長期烏蘇里貉糞便菌群的影響

ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表示菌群的豐富度，香農(nóng)指數(shù)表示菌群的多樣性。多數(shù)研究表明，糞腸球菌能夠提高糞便菌群的豐富度和多樣性[4,15]；但也有試驗(yàn)表明糞腸球菌降低了糞便菌群的豐富度和多樣性[16]。本試驗(yàn)中，與對照組相比，Ⅰ組生長期烏蘇里貉糞便菌群ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著提高，而香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)無顯著差異，說明2組菌群結(jié)構(gòu)相似，但糞腸球菌提高了菌群的豐富度。此外，與Pajarillo等[15]報(bào)道的糞腸球菌使斷奶仔豬糞便中擬桿菌門相對豐度升高的結(jié)果一致，本研究中Ⅰ組擬桿菌門相對豐度較對照組顯著提高，可能與其生長性能提高有關(guān)。乳酸桿菌作為腸道有益菌，在采用菌落培養(yǎng)方法研究益生菌對腸道菌群的影響中受到廣泛關(guān)注，并有研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌可以提高糞便乳酸桿菌菌落數(shù)[2-3]。菌落培養(yǎng)方法只檢測特定的微生物群落，導(dǎo)致研究范圍有限。以細(xì)菌群落分析為目標(biāo)的16S rRNA基因測序技術(shù)的出現(xiàn)，使大量不能培養(yǎng)的菌種被檢出，從而能夠更廣泛地了解益生菌對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。研究表明，采用16S rRNA基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)糞腸球菌可增加糞便中乳桿菌屬的相對豐度[14]，但也有試驗(yàn)表明糞腸球菌并未使糞便菌群中乳桿菌屬的相對豐度提高[17]。Hu等[11]利用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)糞腸球菌不影響糞便中細(xì)菌總數(shù)，但能提高乳桿菌屬的相對豐度，而利用16S rRNA基因測序技術(shù)卻未發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬組成和多樣性出現(xiàn)差異。本研究與Hu等[11]一致，也未觀察到糞腸球菌對乳桿菌屬的影響，這可能與16S rRNA基因測序技術(shù)鑒定出的大多數(shù)不能培養(yǎng)的菌種均屬于厚壁菌門有關(guān)[15]。巨球型菌屬是腸道乳酸和糖發(fā)酵菌種，可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對營養(yǎng)物質(zhì)消化和腸道健康具有重要作用[18]。目前對小桿菌屬、Catenisphaera和光岡菌屬的作用研究很少，但通過16S rRNA基因測序技術(shù)在豬糞中發(fā)現(xiàn)了潛在致病性的小桿菌屬菌種[19]。Pajarillo等[15]報(bào)道，糞腸球菌使斷奶仔豬糞便中大腸桿菌和小桿菌屬相對豐度降低。本試驗(yàn)中，與對照組相比，Ⅰ組巨球型菌屬相對豐度顯著提高，小桿菌屬相對豐度顯著降低，這提示糞腸球菌可能通過促進(jìn)有益菌的增殖和抑制潛在病原菌的生長來改善生長期烏蘇里貉的生長性能和腸道菌群的平衡。

4 結(jié) 論

飼糧添加糞腸球菌能夠提高生長期烏蘇里貉生長性能，改善氮利用率，促進(jìn)有益菌增殖，抑制潛在病原菌生長，添加水平以1×108CFU/kg較為適宜。