植物提取物活性成分鑒定方法研究進展

方洛云 蔣林樹

(北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206)

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第1773號將中草藥、藥食同源植物中篩選的具有飼用可行性和顯著的保健功效的115種天然植物列入《飼料原料目錄》。在2019年頒布的《天然植物飼料原料通用要求》中明確了可飼用天然植物作為飼料原料或添加劑使用的加工方式和標準，促進了可飼用天然植物在飼料加工中的應(yīng)用[1]。

植物提取物就是以天然植物為原料，經(jīng)過物理和/或化學提取分離過程，定向獲取和濃縮植物中的某一種或多種有效活性成分，而不改變其有效成分結(jié)構(gòu)形成的產(chǎn)品[2]。飼用植物提取物具有天然、綠色、毒副作用小等優(yōu)點，在飼料工業(yè)中日益受到重視。飼料營養(yǎng)活性物質(zhì)是指飼料原料天然存在的或飼料中營養(yǎng)物質(zhì)在飼料加工過程中及在動物體內(nèi)消化代謝過程中產(chǎn)生的，具有諸如促進腸道健康、維持理想的免疫平衡和氧化平衡、調(diào)節(jié)基因表達等特殊營養(yǎng)調(diào)控或保健功能的超微量成分，根據(jù)化學分類方法可將其分為多酚類、寡糖類等[3-4]。由于飼用植物提取物中的活性成分對植物提取物發(fā)揮各項功能起到了重要作用。對這些活性成分進行定性、定量鑒定也成為動物營養(yǎng)研究的熱點之一。

1 植物提取物活性成分主要鑒定方法

植物提取物是一個非常龐大的復(fù)雜體系，復(fù)雜性體現(xiàn)在植物提取物所含成分的種類多、含量差異大，不僅理化性質(zhì)差異大，結(jié)構(gòu)差異也大。而要有效利用植物提取物，就必須運用現(xiàn)代高新技術(shù)和各種化學、物理方法來定性、定量測定植物提取物中的活性成分。目前，測定植物提取物中活性成分的方法主要有光譜法、色譜法、質(zhì)譜法及它們的聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)等。

1.1 光譜法

1.1.1 紫外-可見分光光度法

紫外-可見分光光度法是在190～800 nm波長內(nèi)測定樣品的吸光度，用于定性、定量鑒定的方法。該方法靈敏度較高、操作方便。例如，紫外-可見分光光度法雖不能鑒定出柑橘提取物和沙棘提取物中各種黃酮的具體成分，但可以快速、簡便地測定柑橘提取物和沙棘提取物中總黃酮含量。這是實驗室用來測定植物提取物中總黃酮含量的快檢手段之一[5]。

1.1.2 紅外吸收光譜法

紅外吸收光譜法主要是利用被測物質(zhì)的分子對不同波長的紅外輻射吸收程度不同而對物質(zhì)進行分析的方法[2]。紅外圖譜能給出樣品中所有化學成分的結(jié)構(gòu)信息，在植物提取物活性成分測定方面有較好的應(yīng)用前景。在植物提取物的鑒定中，紅外光譜法常與其他理化方法聯(lián)合使用，如紅外光譜與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)可對多酚類物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定[6]。

1.1.3 核磁共振光譜法

核磁共振光譜法是將核磁共振現(xiàn)象應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)測定的一種技術(shù)。目前波普研究主要集中在H譜和C譜2類原子核的波譜，核磁共振波譜可以提供分子中化學官能團的數(shù)目和種類。核磁共振經(jīng)常用于植物提取物中未知活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定，如通過液相將植物中某一未知成分純化和提取，將獲得的單體進行核磁共振，比對后可命名該化合物[7]。

1.2 色譜法

色譜法是通過利用植物提取物中的化學成分在固定相和流動相中的分離差異，利用這種差異使活性成分各組分分離，并根據(jù)分離所得到的色譜圖進行植物提取物的鑒別[2]。色譜法能對植物提取物中活性成分進行定性和定量分析，是目前對植物提取物活性成分進行檢測的最主要的方法。液相色譜與質(zhì)譜、核磁共振等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用是對植物提取物活性成分進行深度分析的重要手段之一[8]。

1.2.1 薄層色譜法

薄層色譜法是將適宜的固定相涂布于薄板上形成一均勻薄層，根據(jù)樣品的比移(Rf)值與對照品的色譜圖的Rf值進行對比，用以對樣品化學成分進行分離、鑒定的一種層析分離技術(shù)。薄層色譜法在植物提取物活性成分的定性和定量分析方面有著非常廣泛的應(yīng)用。例如，孫熙寧等[9]采用薄層色譜法測定了構(gòu)樹葉中的牡荊素和芹菜素；于姍姍等[10]采用薄層色譜法測定了槐枝中蘆丁的含量。

1.2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法是以液體為流動相，將待測樣品的溶劑、緩沖液等流動相泵入色譜柱，根據(jù)樣品不同成分與固定相的相互作用差異，不同成分依次脫離色譜柱時得到不同的峰信號，通過分析比對峰信號實現(xiàn)對樣品分析。高效液相色譜法可用于鑒定植物提取物中的多酚類、生物堿類、皂苷類、黃酮類等化合物以及多肽、多糖等生物大分子。

1.2.3 氣相色譜法

氣相色譜法以氣體為流動相，利用待測樣品的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。氣相色譜法可用于測定植物提取物中的脂肪酸、有機酸、植物精油等，尤其是在對植物精油的鑒別中發(fā)揮著重要作用。

1.2.4 超臨界流體色譜法

超臨界流體色譜法是以超臨界流體做流動相，依靠流動相的溶劑化能力來進行分離、分析的色譜過程。超臨界流體色譜兼有氣相色譜和液相色譜的特點，常以二氧化碳為流動相，在定性、定量方面有較大的優(yōu)勢，還可以用多種梯度技術(shù)來優(yōu)化色譜條件。鑒于超臨界流體更強的溶解性和更大的擴散系數(shù)，超臨界流體色譜法可用于分析鑒定植物精油等。

1.3 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜法和質(zhì)譜結(jié)合起來，通過色譜法將植物提取物中不同活性成分進行分離，對分離后的活性成分運用質(zhì)譜法進行定性和定量檢測。例如，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對黃酮類化合物進行分離、鑒定等，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對植物提取物中易揮發(fā)性物質(zhì)如植物精油、脂肪酸等進行定性、定量測定等[11]。

1.4 其他方法

對植物提取物中的活性成分進行定性、定量分析的方法還有電化學分析法、毛細管電泳法、近紅外光譜法、單晶衍射法以及多種技術(shù)聯(lián)用等方法。

2 植物提取物中主要活性成分鑒定

2.1 多酚

多酚廣泛存在于各種植物，由于其對人類和動物具有抗氧化、抗炎、提高免疫力、調(diào)控脂質(zhì)代謝等各項生理而引起科研工作者的廣泛關(guān)注。多酚按照結(jié)構(gòu)分為類黃酮和非類黃酮化合物(芪、酚酸和木酚素等)兩大類，前者包括花色苷、黃酮醇和黃烷酮等，后者包括咖啡酸、阿魏酸、綠原酸等小分子酚酸以及白藜蘆醇等[12]。薛宏坤等[13]用紫外-可見光譜掃描葡萄皮色素的粗提物樣品溶液，發(fā)現(xiàn)在280、520、330 nm波長處均有吸收峰，說明樣品中的主要活性成分為花色苷類，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對分離所得的花色苷類進行結(jié)構(gòu)鑒定，得出3種糖苷。鐘迪穎[14]通過傅里葉紅外光譜分析儀和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對紫花苜蓿花朵中的花色苷進行了鑒定，共得到13種花色苷單體，包含9種花色苷和4種花色苷衍生物。楊煒琪等[15]采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS/MS)在線快速分離鑒定降香中的黃酮類化學成分，鑒定出了27個主要色譜峰。伏建峰等[16]應(yīng)用高效液相色譜對黃芩水提液進行分離純化，對目標化合物采用質(zhì)譜、核磁共振和紅外光譜等技術(shù)進行結(jié)構(gòu)解析，確證目標化合物為2′,5,6′,7-四羥基二氫黃酮醇。王映紅等[17]采用高效液相色譜-質(zhì)譜法與高效液相色譜-核磁共振氫譜法對土茯苓提取液中的二氫黃酮醇苷類成分進行分析鑒定，結(jié)果從土茯苓中鑒定出4個二氫黃酮醇苷異構(gòu)體。瞿志杰等[18]采用半制備液相色譜與制備薄層色譜聯(lián)用技術(shù)快速純化玉竹中4種高異黃烷酮，通過核磁共振譜、質(zhì)譜及紫外光譜進行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定出了這4種黃烷酮化合物的結(jié)構(gòu)。劉紅兵等[19]利用液相-固相萃取-核磁共振/質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)成功鑒定出了牛至植物中的咖啡酸三聚體類化合物。陳燕飛等[20]采用薄層色譜法對冬葵子的化學成分進行了定性檢測，從中分離鑒定出了阿魏酸。張國升等[21]采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定和鑒定了蘆根中阿魏酸的含量和結(jié)構(gòu)。潘明飛等[22]采用紅外光譜、紫外光譜、質(zhì)譜和核磁H譜、C譜對獲得的金銀花綠原酸進行了化學結(jié)構(gòu)鑒定。閆仲麗等[23]采用質(zhì)譜法定量分析了果漿保健品中白藜蘆醇的含量。

在植物提取物研究領(lǐng)域，對多酚的測定基本是追隨中草藥的測定方法。隨著測定技術(shù)的發(fā)展，對多酚的定性測定已從最初的紫外-可見光到指紋圖譜，再到最新的DNA圖譜；對多酚的定量測定也從植物提取物總量測定發(fā)展到了靶向或非靶向化合物的含量測定。

2.2 植物多糖

植物多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)腸道等多種生物功能，能夠改善動物生長性能，提高機體免疫力，改善腸道健康。多糖的結(jié)構(gòu)與功能存在著密切的關(guān)系，不同的分子結(jié)構(gòu)和不同的分子質(zhì)量都會影響到多糖的生物活性，因此十分有必要對多糖結(jié)構(gòu)進行鑒定。李勝男等[24]采用凝膠滲透色譜法測定了肉桂的相對分子質(zhì)量，采用柱前衍生高效液相色譜法測定了肉桂中性多糖的單糖組分，通過甲基化法和核磁共振法測定了其單糖的連接方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉桂的主要單糖為葡萄糖，單糖有3種連接方式。朱靜堅等[25]采用高效液相色譜法測定了白術(shù)單糖的衍生物，得到指紋圖譜，通過白術(shù)多糖指紋圖譜鑒別出了5個共有峰，分別為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。王國明等[26]采用傳統(tǒng)水提法、快速溶劑萃取(FSE)技術(shù)提取人參、西洋參多糖，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析其中的單糖組成，結(jié)果表明，人參多糖及西洋參多糖均由阿拉伯糖、鼠李糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖組成。

雖然目前采用液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)對多糖進行檢測已經(jīng)相對成熟，但由于多糖高級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對多糖的多維結(jié)構(gòu)與功能之間的構(gòu)-效關(guān)系的深入研究還略為不足，還需采用更多的檢測技術(shù)如核磁共振等對多糖的高級結(jié)構(gòu)進行鑒定。

2.3 植物精油

植物精油是從植物中提取和分離得到的具有芳香味的油狀物質(zhì)，其對動物具有多種生物調(diào)控作用。黃婷[11]采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析了4種樟屬植物精油的40余種化學成分。李敏等[27]采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)對巨鹿金銀花精油進行了提取，并采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒別出了金銀花精油成分。Santerre等[28]比較了經(jīng)典氣相色譜技術(shù)和超臨界流體色譜技術(shù)對檸檬精油定性、定量結(jié)果的差異，獲得了相類似的結(jié)果。Li等[29]采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對山蒼子精油的化學成分進行了鑒定和定量分析，含量最高的3種化學成分分別為反式檸檬醛、順式檸檬醛和d-檸檬烯。Sonmezdag等[30]通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對開心果油中的揮發(fā)性成分進行了測定，各物質(zhì)檢出濃度為0.07～2.26 mg/kg，檢出限和定量限均能滿足檢測要求。Napolitano等[31]通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對榛子中的油脂類進行了測定，約82種油脂被檢測出，某些油脂是第1次被檢出。

植物精油具有部分替抗、減抗的功能，因而引起了飼料行業(yè)的極大關(guān)注。目前已有產(chǎn)品投入市場，針對植物精油的定性、定量研究工作也成為精油產(chǎn)品品控的關(guān)鍵。目前國內(nèi)外對植物精油的檢測方式多以氣相色譜法檢測為主。飼用植物精油的檢測多脫胎于醫(yī)藥行業(yè)、化妝品行業(yè)的檢測方法，對飼用植物精油本身所特有的一些特征組分研究甚少，這將是今后飼用植物精油基礎(chǔ)研究的重要部分。

2.4 有機酸

有機酸包括有檸檬酸、乳酸、抗壞血酸、綠原酸等，植物中的有機酸一般都與鉀、鈉、鈣等結(jié)合成鹽，有些與生物堿結(jié)合成鹽。目前對植物提取物中有機酸的檢測相對成熟，以高效液相色譜法最為常用。陳松輝等[32]建立了通過離子色譜法來測定飼料添加劑中甲酸、乳酸、檸檬酸的檢測方法。許金華等[33]采用高效液相色譜法測定了五味子中檸檬酸的含量，結(jié)果顯示4種五味子中檸檬酸的平均含量分別為172.8、127.1、126.5和117.9 mg/g。王彥平等[34]建立了應(yīng)用高效液相色譜法同時測定青貯飼料桑中乳酸、乙酸和丙酸含量的方法，測定結(jié)果顯示乳酸、乙酸和丙酸在一定濃度下具有良好的線性關(guān)系，3種物質(zhì)檢出限為4.928～9.489 mg/L，該方法適用于青貯飼料桑中有機酸的定量檢測。

2.5 生物堿

生物堿是一類含氮堿性有機物，是某些飼用植物提取物中的有效成分。阿不力米提等[35]以白喉烏頭不同部位為試驗材料，采用無水乙醇超聲波法提取烏頭堿，利用分光光度計于231 nm波長條件下測定吸光度，計算總生物堿的含量，結(jié)果表明，烏頭堿在0.000 4～0.002 0 mg/L濃度內(nèi)線性關(guān)系良好。代珊等[36]通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測定不同附子炮制品中烏頭堿、新烏頭堿等14種生物堿的含量，采用化學計量學分析不同附子炮制品的差異，結(jié)果表明，各生物堿在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。錢茂升等[37]結(jié)合柱色譜法和紫外分光光度法，以鹽酸小檗堿為對照品，黃連下腳料為供試品，在波長229 nm處測定黃連下腳料中生物堿的吸光度，依據(jù)鹽酸小檗堿對照品吸光度與濃度之間的定量關(guān)系，計算出了黃連下腳料中生物堿的含量。王昊天等[38]應(yīng)用高效液相色譜法對31批不同產(chǎn)地的苦參所含的4種生物堿(槐定堿、苦參堿、槐果堿、氧化苦參堿)的含量進行了測定，并建立了指紋圖譜。目前，對植物提取物中生物堿的鑒定方法主要包括色譜法[39]、紫外分光光度計法[40]、電泳法[41]等，這些方法為植物提取物中生物堿的定性、定量檢測提供了技術(shù)保障。

3 小結(jié)與展望

隨著我國禁抗時代的到來，飼料工業(yè)對植物提取物的需求進一步擴大，植物提取物中活性成分的種類和含量檢測成為植物提取物生產(chǎn)與品控的關(guān)鍵，也成為植物提取物產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要前提。

隨著現(xiàn)代檢測技術(shù)不斷更新?lián)Q代，為飼用植物提取物活性成分的定性、定量檢測提供了強有力的技術(shù)支撐，使其取得了較大進展，但也存在以下不足：第一，由于飼用植物提取物研究脫胎于中草藥提取物，因此，它的檢測標準和檢測數(shù)據(jù)庫非常依賴于中草藥活性成分研究進度。對某些不具有醫(yī)用價值的植物提取物，由于中醫(yī)藥標準品數(shù)據(jù)庫中無相應(yīng)的標準品，就導致對某些飼用植物提取物的測定束手無策，因此，對某些特定的使用廣泛的飼用植物提取物還需要加大基礎(chǔ)研究力度。第二，由于植物提取物具有多組分、多靶點的復(fù)雜體系，科研工作者對天然植物中的生物活性成分雖然已有所了解，但對其研究不多，對不同組分之間相互作用機制更缺少研究。第三，植物提取物中的活性成分可列為飼料營養(yǎng)成分組成，也可作為飼料配方的重要參考，但還需開展更多的基礎(chǔ)研究工作。

總之，持續(xù)開展植物提取物活性成分這一領(lǐng)域的研究將為傳統(tǒng)飼料科學整體現(xiàn)代化發(fā)展開辟出新方向和新領(lǐng)域。