CK19及Galectin-3在甲狀腺乳頭狀癌合并橋本氏甲狀腺炎的表達(dá)及臨床意義

高 丹 吳 影 付雪蓮 李淑蓮 李化敏 董祥梅 付 瑤

（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院病理診斷中心，黑龍江 牡丹江， 157000）

近年來甲狀腺癌發(fā)病率明顯上升，且女性發(fā)病率明顯高于男性[1]。臨床病理將甲狀腺癌主要分為甲狀腺髓樣癌、濾泡狀甲狀腺癌、甲狀腺乳頭狀癌和未分化甲狀腺癌。甲狀腺乳頭狀癌（PCT）是最常見的一種甲狀腺癌類型，占80%左右，多表現(xiàn)為甲狀腺腫塊與淋巴結(jié)腫大，多在體檢過程中發(fā)現(xiàn)[2]。PCT的惡性程度在所有甲狀腺癌病理分型中最輕微，而且一般患者病程進(jìn)展緩慢，預(yù)后相對(duì)良好。橋本甲狀腺炎（HT）屬于自身免疫性疾病的一種，患者伴隨典型的甲狀腺分泌過多，屬于臨床常見病與多發(fā)病。HT多發(fā)病緩慢，但是患者病程較長(zhǎng)，容易反復(fù)發(fā)作。隨著臨床上對(duì)甲狀腺乳頭狀癌和橋本甲狀腺炎研究進(jìn)展加深，許多學(xué)者認(rèn)為，HT可以演變成PCT，且臨床上兩者共同發(fā)病的情況比較多見[3]。隨著臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展，雖然多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌能夠在超聲下觀察其良惡性病變程度，但是仍然需要病理組織檢驗(yàn)作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。在病理診斷中，由于甲狀腺乳頭狀癌合并橋本氏甲狀腺炎（PCT-HT）的特殊性，單純依照形態(tài)學(xué)診斷較為困難。隨著生物分子學(xué)研究進(jìn)展加深，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[5-6]，應(yīng)用醫(yī)學(xué)分子標(biāo)記物能夠有助于診斷PCT-HT。因此，本研究分析細(xì)胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）及半乳糖凝集素-3（Gralection-3）在PCT-HT的表達(dá)及臨床意義，具體報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月～2021年8月牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院收治的100例PCT-HT患者作為觀察組，另選取同期來牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院治療的100例單純甲狀腺乳頭狀癌患者作為對(duì)照組，進(jìn)行回顧性分析。對(duì)照組患者中，男33例，女67例；年齡38～62歲，平均年齡（51.30±3.57）歲；病程1～3年，平均病程（2.03±0.24）年。觀察組患者中，男46例，女54例；年齡37～66歲，平均年齡（51.29±3.42）歲；病程為1～3年，平均病程（2.25±0.35）年。兩組患者一般資料對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者對(duì)本研究知情并簽署同意書。本研究經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理診斷確診為甲狀腺癌，且病理分類為乳頭狀癌[7]；抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺過氧化物酶自身抗體、抗甲狀腺微粒體抗體等指標(biāo)異常；年齡≥18歲；臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：病情不穩(wěn)定，存活期＜3個(gè)月；在研究前有放射線接觸史者；合并自身免疫缺陷類疾病者；合并甲狀腺功能亢進(jìn)者；合并其他惡性腫瘤者；合并慢性感染類疾病者；合并精神類疾病者。

1.3 方法

一般資料收集：選取牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院2017年8月～2021年8月收治的100例PCT-HT患者及100例單純甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行回顧性分析，收集所有患者一般臨床資料，其中包括患者的性別、病程、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤侵犯性（甲狀腺腺外侵襲、包膜侵襲性或無侵襲）、臨床分期等。

CK19及Galectin-3表達(dá)檢測(cè)：應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)CK19及Galectin-3表達(dá)。具體方法為：所有標(biāo)本均采取石蠟進(jìn)行常規(guī)包埋，并進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4 μm，在60 ℃下烘烤90 min。隨后應(yīng)用EnVision法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)依照試劑盒說明書進(jìn)行，取2 mL肝素進(jìn)行抗凝血處理，隨后加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）進(jìn)行稀釋，直到液體為4 mL位置，隨后加入淋巴分離液2 mL，以2 000 r/min的速度進(jìn)行20 min離心后吸取單個(gè)細(xì)胞核。并注意需要在PBS洗滌之后將細(xì)胞與抗體異硫氰酸熒光素進(jìn)行孵育30 min，再次應(yīng)用PBS洗滌放置到PBS懸浮液之中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀觀測(cè)其實(shí)際情況，應(yīng)用PBS代替檢測(cè)過程中的一抗作為主要的陰性對(duì)照分析樣本，并應(yīng)用已知患者的陽性甲狀腺組織作為免疫組化的陽性對(duì)照組織，從而分析不同組織中CK19及Galectin-3的表達(dá)水平。應(yīng)用顯微鏡觀察所有受檢患者甲狀腺組織的實(shí)際切片染色情況，將顯微鏡視野調(diào)整為400倍后進(jìn)行觀察，并依照組織所表現(xiàn)的染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞比例對(duì)CK19及Galectin-3的表達(dá)水平進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。其中，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。并在顯微鏡下觀察甲狀腺組織切片染色情況，以400倍視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞進(jìn)行綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分：棕褐色為3分，棕黃色為2分。染色陽性細(xì)胞數(shù)＞75%為5分，50%～75%為5分，25%～50%為2分，5%～25%為1分，＜5%為0分。最終，根據(jù)患者甲狀腺組織的細(xì)胞數(shù)量和染色實(shí)際強(qiáng)度來判斷CK19及Galectin-3表達(dá)是否為陽性。0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）[8]。弱陽性（+）、陽性（++）、強(qiáng)陽性（+++）均為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；采用Spearman相關(guān)分析方法分析CK19及Galectin-3與PCT-HT的相關(guān)性；應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)CK19及Galectin-3對(duì)PCT-HT診斷的價(jià)值；采用Logistic回歸分析分析上述指標(biāo)對(duì)患者的獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值；用ImageProPlus軟件分析免疫組化結(jié)果。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床特征與CK19及Galectin-3表達(dá)水平對(duì)比

兩組患者性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組患者腫瘤侵犯性、臨床分期、CK19與Galectin-3表達(dá)情況對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），觀察組腫瘤侵犯性為無的占比明顯低于對(duì)照組，臨床分期I～I(xiàn)I的占比明顯低于對(duì)照組，CK19與Galectin-3陽性占比明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。HE和SP法染色顯示，兩組CK19與Galectin-3表達(dá)均為陽性，對(duì)照組表達(dá)稍微高一些。見圖1。

圖1 兩組HE染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表1 兩組患者臨床特征與CK19及Galectin-3表達(dá)水平對(duì)比（[-x±s）/n（%）]

2.2 CK19及Galectin-3與PCT-HT的相關(guān)性

Spearman相 關(guān) 分 析 結(jié) 果 顯 示CK19及Galectin-3與PCT-HT呈正相關(guān)（r=0.423、0.539，P＜0.05）。見表2。

表2 CK19及Galectin-3與PCT-HT的相關(guān)性

2.3 CK19及Galectin-3對(duì)PCT-HT的診斷價(jià)值

CK19診斷PCT-HT價(jià)值曲線下面積為89.63，最佳診斷著色界限值為75.73%，Galectin-3的曲線下面積為78.89，最佳色界限值為82.53%。logistic回歸分析結(jié)果表明CK19及Galectin-3對(duì)PCT-HT具有獨(dú)立預(yù)測(cè)價(jià)值（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 CK19及Galectin-3對(duì)PCT-HT的ROC曲線圖

表3 CK19及Galectin-3對(duì)PCT-HT的診斷價(jià)值

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，PCT與HT存在著密切關(guān)系，PCTHT發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，HT罹患甲狀腺癌的概率較正常人增加2倍，并且合并HT的患者較未合并者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增高。PCT的癌細(xì)胞一般呈現(xiàn)出濾泡狀或乳頭狀排列狀態(tài)，并且乳頭的軸心會(huì)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，而且癌細(xì)胞和病變的HT組織相互混合在一起，癌細(xì)胞以點(diǎn)狀的散播樣式分布在甲狀腺組織和HT組織中。HT發(fā)病后患者的甲狀腺組織呈腫大狀態(tài)，且對(duì)稱分布，被膜表面比較光滑，輕微增厚，質(zhì)地韌性較大，與周圍組織無粘連現(xiàn)象。有學(xué)者認(rèn)為[11]，HT的發(fā)生會(huì)促使甲狀腺乳頭狀癌發(fā)展，也是癌前病變的一種，CK19出現(xiàn)異常高表達(dá)或BRAF突變可能對(duì)于HT癌變產(chǎn)生一定作用。另外有研究認(rèn)為[12]，甲狀腺乳頭狀癌誘導(dǎo)的癌周淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可能誘導(dǎo)HT的發(fā)生。因此，應(yīng)用有效的分子生物學(xué)法輔助診斷PCT-HT具有重要價(jià)值。CK19屬于低分子量細(xì)胞角蛋白，在各種腫瘤和上皮組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，CK19在甲狀腺乳頭狀癌中呈現(xiàn)彌漫高表達(dá)現(xiàn)象。Galectin-3屬于β-半乳糖苷與蛋白動(dòng)物凝集素結(jié)合的家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，Galectin-3在胃癌、乳腺癌、喉癌、膀胱癌、甲狀腺乳頭狀癌等癌癥均存在高表達(dá)。因此，本研究對(duì)CK19、Galectin-3在PCT-HT的表達(dá)和臨床意義展開分析，希望能夠?yàn)镻CT-HT的診斷提供參考價(jià)值。

本研究結(jié)果表明，兩組患者腫瘤侵犯性、臨床分期、CK19與Galectin-3表達(dá)情況對(duì)比差異顯著，觀察組腫瘤侵犯性為無的占比明顯低于對(duì)照組，臨床分期I～I(xiàn)I的占比明顯低于對(duì)照組，CK19與Galectin-3陽性占比明顯高于對(duì)照組。由此證明，PCT-HT患者的腫瘤侵犯程度較為嚴(yán)重，且CK19與Galectin-3表達(dá)水平更高。這可能是因?yàn)?，HT會(huì)通過濾泡上皮細(xì)胞過度增生，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫驮錾?，最終發(fā)展為PCT。不過，與以往的研究有出入，可能與樣本量的差異性有關(guān)。另外，在PCT中Galectin-3和CK19的表達(dá)意義已從大量研究中得以印證，兩者聯(lián)合應(yīng)用可提高PCT臨床診斷的敏感度；但這兩種抗體在橋本氏甲狀腺炎合并有甲狀腺乳頭狀癌（PCT）核樣不典型細(xì)胞的情況時(shí)，同樣呈陽性表達(dá)，這使得兩者在臨床工作中更加難以診斷。本研究顯示PCT-HT的發(fā)生與濾泡上皮細(xì)胞非典型增生具有明顯相關(guān)性，也可能是PCT的早期事件[16]；Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示CK19及Galectin-3與PCT-HT呈正相關(guān)（r=0.423、0.539，P＜0.05）。由此證明，PCT-HT患者組織內(nèi)CK19及Galectin-3呈現(xiàn)更高的表達(dá)狀態(tài)。這可能是因?yàn)?，Galectin-3能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化與生長(zhǎng)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲等[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18-19]，CK-19在PCT總的診斷敏感度較高，對(duì)于甲狀腺腫瘤的診斷準(zhǔn)確率為22.6%，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫瘤為21.1%，HT為33.3%，PCT為98.5%。因此，CK19與PCT-HT的相關(guān)性更高；CK19診斷PCT-HT價(jià)值曲線下面積為89.63，最佳診斷著色界限值為75.73%，Galectin-3的曲線下面積為78.89，最佳色界限值為82.53%。由此證明，CK19與Galectin-3在PCT-HT患者中具有較高的診斷價(jià)值。黃力營(yíng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-3和CK19在診斷甲狀腺乳頭狀微小癌和非典型濾泡上皮增生中具有重要價(jià)值，診斷準(zhǔn)確率較高，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，PCT-HT患者腫瘤侵犯性、臨床分期較高，CK19與Galectin-3陽性表達(dá)占比較高，并且CK19免疫組化著色面積＞75.73%，Galectin-3＞82.53%是PCT-HT的相關(guān)危險(xiǎn)因素。