異秦皮素腹腔注射對腦梗死大鼠的治療作用及其作用機(jī)制

陳歷，季一飛，尹書斌，趙玉萍

南充市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川南充637000

腦梗死是指由于大腦供血異常而引起腦組織缺血、缺氧壞死，梗死后急性期存在如神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡等許多病理過程［1］。盡管目前已經(jīng)探索了一些治療腦梗死的分子靶點(diǎn)，但其臨床應(yīng)用仍不盡人意。因此，迫切需要開發(fā)能夠抑制梗死腦組織中神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡等臨床可行的藥物。NLRP3炎癥小體是一種亞細(xì)胞多蛋白復(fù)合物［2］，包括NLRP3和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）等重要蛋白，其活化后促進(jìn)IL-18和IL-1β的產(chǎn)生［3］。研究表明，抑制NLRP3表達(dá)可降低腦損傷后氧化應(yīng)激水平及炎癥損傷程度，從而顯著減少梗死面積［4］。因此，我們推測一些阻止NLRP3炎癥小體激活的藥物可能有助于減弱腦梗死。異秦皮素（ISO）是從刺五加提取的一種香豆素類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，ISO可以抑制NLRP3炎癥小體激活，從而改善心肌梗死預(yù)后［5］。然而，ISO在腦梗死中的具體功能及其與NLRP3炎癥小體之間的相互作用尚不清楚。2021年11月—12月，我們初步觀察了ISO對大鼠腦梗死損傷的治療作用，并從細(xì)胞學(xué)角度分析ISO對NLRP3炎癥小體的調(diào)控關(guān)系，旨在為腦梗死的臨床治療提供一種新藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料雄性SD大鼠（220～240 g）購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周；本研究嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：異秦皮素購自武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、ROS試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TNF-α試劑盒、IL-6試劑盒、IL-10試劑盒、IL-1β試劑盒、IL-18試劑盒、凋亡檢測試劑盒、NLRP3抗體試劑盒、ASC抗體試劑盒、GAPDH抗體試劑盒、NLRP3激動劑Nigericin購自Abcam公司；SDSPAGE凝膠制、PVDF膜、ECL檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；戊巴比妥鈉、神經(jīng)細(xì)胞株P(guān)C-12細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 ISO對腦梗死大鼠的治療作用觀察

1.2.1 腦梗死模型建立及ISO處理將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、藥物1組和藥物2組，每組均8只。藥物1、2組及模型組均采用線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈栓塞（MCAO）模型［6］。藥物1、2組分別腹腔注射10、20 mg/kg的ISO，1次/d，假手術(shù)組、模型組腹腔注射相同體積生理鹽水，1次/d，持續(xù)8周。取相應(yīng)標(biāo)本做后續(xù)的研究。

1.2.2 神經(jīng)行為評估再灌注1 d及8周后，由兩位實(shí)驗(yàn)人員參照Zea-Longa神經(jīng)功能障礙評分。其中評分為1～4分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，評分為5分的大鼠剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.3梗死側(cè)腦水腫觀察大鼠麻醉后，每組取6只斷頭取腦，去除小腦、腦干及嗅球；用電子分析天平（精確度為0.01 mg）測定大腦濕重（ww），將其包入錫箔紙放置烤箱中72 h后稱取大腦干重（dw），以干濕比重法評估梗死側(cè)腦水腫變化［7］。腦組織含水量=（ww-dw）/ww×100%。

1.2.4 腦組織病理學(xué)觀察神經(jīng)功能評估后，每組取6只腹腔注射戊巴比妥鈉5 mg/kg。麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于木板上，剪開腹腔，暴露心臟；經(jīng)左心室灌流至肉眼觀察到生理鹽水基本無色和肝臟完全變黃后停止沖洗，再以4%多聚甲醛灌注固定；大鼠全身僵硬后斷頭取腦組織，在視交叉后1 mm及5 mm處冠狀切面切開，取中間腦組織。將其置于4%多聚甲醛固定液4℃下固定24 h，石蠟包埋后以4 μm厚切片，分別行HE、TUNEL、Nissl染色觀察神經(jīng)元損傷情況。

1.2.5 腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA、SOD檢測采用ELISA法檢測腦組織中的ROS、MDA、SOD，按試劑盒說明書操作。

1.2.6 血清及腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10檢測大鼠麻醉后腹主動脈采血，采用ELISA法檢測血清及腦組織中TNF-α、IL-6、IL-10，按試劑盒說明書操作。

1.2.7 腦組織中NLRP3炎癥小體關(guān)鍵蛋白NLRP3、ASC及其活化標(biāo)志IL-18、IL-1β檢測采用Western blotting法。將腦組織用RIPA緩沖液裂解，再用快速金B(yǎng)CA蛋白測定試劑盒測定濃度，以10%SDS-PAGE分離蛋白產(chǎn)物并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在PVDF膜中分別加入NLRP3、ASC和GAPDH的一抗4℃下孵育過夜，再分別將二抗在室溫下孵化1 h。用化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的分子量和凈光密度值。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 ISO對氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）細(xì)胞活力、凋亡及NLRP3炎癥小體的作用觀察

1.3.1 細(xì)胞分組、建模與ISO處理將PC12細(xì)胞接種在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃溫箱培養(yǎng)，培養(yǎng)液2 d更換1次。待細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶壁70%～80%時(shí)，按照1∶4傳代，將細(xì)胞分為模型組、對照組及干預(yù)組。模型組及干預(yù)組制作OGD/R細(xì)胞模型時(shí)，先將細(xì)胞在37℃、5%CO2、95% N2無糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，加入完整的DMEM后暴露在95%空氣、5%CO2的常氧環(huán)境中24 h，同時(shí)干預(yù)組分別給予ISO 10、50、100 μmol/L處理。對照組不進(jìn)行氧葡萄糖剝奪過程，其與OGD/R組滴加等體積培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞活力觀察采用MTT法。37℃下將各組細(xì)胞接種96孔板（2×105/孔），培養(yǎng)24 h后每孔加20 μL MTT，2 h后用Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀進(jìn)行細(xì)胞活力測定，以細(xì)胞存活率表示細(xì)胞活力。細(xì)胞存活率=OD干預(yù)組/OD對照組×100%。選取干預(yù)組中細(xì)胞活力最早出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的ISO處理濃度，作為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中干預(yù)組的處理濃度。

1.3.3 細(xì)胞凋亡觀察采用流式細(xì)胞儀。收集各組細(xì)胞，以1×105/孔接種96孔板；培養(yǎng)24 h后用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行V-FITC和PI染色，25℃黑暗20 min，采用流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。

1.3.4 細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、MDA、LDH檢測ROS、MDA檢測方法同“1.2.5”，用LDH測定試劑盒測以Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀分析LDH水平。

1.3.5 細(xì)胞中NLRP3炎癥小體關(guān)鍵蛋白NLRP3、ASC及其活化標(biāo)志IL-18、IL-1β檢測細(xì)胞培養(yǎng)同“1.3.1”，將細(xì)胞分為四組。模型組和對照組處理同“1.3.1”，干預(yù)組予以“1.3.2”篩選的ISO濃度處理，干預(yù)+激動劑組在加入ISO的同時(shí)加NLRP3激動劑Nigericin至終濃度為5 μmol/L；NLRP3、ASC及IL-18、IL-1β檢測方法同“1.2.7”。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0軟件。以W-S法檢驗(yàn)計(jì)量資料正態(tài)分布情況，如呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較行單因素方差分析，組間兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ISO對腦梗死大鼠的治療作用

2.1.1 各組神經(jīng)功能評分和腦水腫比較與假手術(shù)組比較，模型組及藥物1、2組神經(jīng)功能評分升高，腦組織含水量增加（P均＜0.01）；與模型組比較，藥物1、2組神經(jīng)功能評分降低，藥物2組腦組織含水量減少（P均＜0.05）；與藥物1組比較，藥物2組神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評分和腦水腫比較（±s）

表1 各組神經(jīng)功能評分和腦水腫比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與藥物1組比較，eP＜0.05。

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2.1.2 各組腦組織損傷情況比較HE染色顯示，假手術(shù)組細(xì)胞輪廓清晰，核仁明顯；模型組及藥物1、2組均出現(xiàn)細(xì)胞輪廓模糊、細(xì)胞變形和水腫等異常；但藥物1、2組較模型組細(xì)胞病理狀態(tài)改善，尤其是藥物2組改善較明顯。TUNEL染色顯示，模型組和藥物1、2組TUNEL陽性細(xì)胞率分別為45.62%±7.34%、26.48%±3.15%、18.46%±2.47%，均高于假手術(shù)組的0.50%±0.06%（P均＜0.01），藥物1、2組TUNEL陽性細(xì)胞率低于模型組（P均＜0.01）。Nissl染色顯示，假手術(shù)組的神經(jīng)元完好無損，而模型組及藥物1、2組神經(jīng)元損傷伴隨細(xì)胞體和核仁萎縮，藥物1、2組特別是藥物2組神經(jīng)元損傷表現(xiàn)減少較明顯。見OSID碼圖1。

2.1.3 各組腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA、SOD比較與假手術(shù)組比較，模型組和藥物1、2組腦組織中ROS、MDA升高而SOD降低；與模型組比較，藥物1、2組腦組織中ROS、MDA降低而SOD升高；與藥物1組比較，藥物2組腦組織中ROS、MDA降低而SOD升高（P均＜0.05）。見表2。1組比較，cP＜0.05。

表2 各組腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA、SOD比較（相對表達(dá)量，±s）

表2 各組腦組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA、SOD比較（相對表達(dá)量，±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與藥物

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2.1.4 各組血清及腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10比較與假手術(shù)組比較，模型組及藥物1、2組血清和腦組織促炎因子TNF-α和IL-6水平升高，藥物1、2組血清和腦組織抗炎因子IL-10升高（P均＜0.01）；與模型組比較，藥物1、2組血清和腦組織TNF-α、IL-6降低而IL-10升高（P均＜0.01）；與藥物1組比較，藥物2組血清和腦組織中TNF-α、IL-6降低而IL-10升高（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組血清及腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10比較（pg/mL，±s）

表3 各組血清及腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10比較（pg/mL，±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與藥物1組比較，cP＜0.05，dP＜0.01。

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2.1.5 各組腦組織中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β比較與假手術(shù)組比較，模型組及藥物1、2組腦組織中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β表達(dá)升高；與模型組比較，藥物1、2組腦組織中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β表達(dá)降低；與藥物1組比較，藥物2組腦組織中ASC、IL-18、IL-1β表達(dá)降低（P均＜0.01）。見表4。

表4 各組腦組織中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β比較（±s）

表4 各組腦組織中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.01；與藥物1組比較，dP＜0.01。

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2.2 ISO對氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）細(xì)胞活力、凋亡及NLRP3炎癥小體的作用

2.2.1 各組細(xì)胞活力比較模型組細(xì)胞活力為56.6%±2.2%，干預(yù)組ISO 10、50、100 μmol/L處理后分別為42.3%±1.9%、67.8%±5.4%、66.9%±1.1%；模型組和干預(yù)組細(xì)胞活力均低于對照組（P均＜0.01），干預(yù)組ISO 50、100 μmol/L處理細(xì)胞活力高于模型組（P均＜0.01）；干預(yù)組ISO 50、100 μmol/L處理細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選取50 μmol/L作為后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)ISO的干預(yù)濃度。

2.2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較模型組、干預(yù)組細(xì)胞凋亡率分為22.34%±2.42%、15.26%±1.91%，均高于對照組的5.87%±0.55%（P均＜0.01），干預(yù)組細(xì)胞凋亡率低于模型組（P＜0.01）。

2.2.3 各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、MDA、LDH比較與對照組比較，模型組和干預(yù)組細(xì)胞LDH、ROS、MDA均升高；與模型組比較，干預(yù)組細(xì)胞LDH、ROS、MDA均降低（P均＜0.01）。見表5。

表5 各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、MDA、LDH比較（±s）

表5 各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、MDA、LDH比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

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2.2.4 各組細(xì)胞中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β比較細(xì)胞中NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18模型組、干預(yù)+模型組＞干預(yù)組＞對照組（P均＜0.01）。見表6。

表6 各組細(xì)胞中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β比較（，±s）

表6 各組細(xì)胞中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β比較（，±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01；與干預(yù)組比較，eP＜0.01。

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3 討論

腦梗死是一種常見的腦血管疾病，在世界范圍內(nèi)病死率和致殘率都很高。腦梗死的臨床管理仍然具有挑戰(zhàn)性，目前仍無令人滿意的臨床防治藥物。缺氧和神經(jīng)炎癥引起的腦損傷貫穿于腦梗死急性期整個(gè)過程［1］，故采取各種措施抑制神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激成為腦梗死治療的主要手段。

研究表明，ISO在多種人類疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，如肺癌、肝癌、骨關(guān)節(jié)炎和白血病。HE等［8］認(rèn)為，ISO可能是一種天然單胺氧化酶B抑制劑，通過抑制一氧化氮和TNF-α的釋放，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；BAI等［9］報(bào)道，ISO對神經(jīng)細(xì)胞軸突和樹突的萎縮具有保護(hù)作用。本研究首先建立模擬人腦梗死的MCAO大鼠模型，發(fā)現(xiàn)ISO能降低腦梗死神經(jīng)功能評分和腦組織含水量，可改善腦腦梗死后出現(xiàn)的神經(jīng)元凋亡、核仁萎縮、水腫等病理表現(xiàn)。因此，我們推測ISO對腦梗死大鼠具有保護(hù)作用，提示ISO可能是一種治療腦梗死的有效藥物。

腦組織容易受到氧化應(yīng)激的影響，其主要原因有神經(jīng)遞質(zhì)自動氧化、線粒體功能紊亂和不飽和脂質(zhì)的富集［10-11］。HEMMATI-DINARVAND等［10］發(fā)現(xiàn)，在帕金森病患者的腦組織中，ROS增加，線粒體功能發(fā)生紊亂。研究發(fā)現(xiàn)，腦組織中ROS和MDA的表達(dá)增加，加速了β-淀粉樣蛋白（Aβ）的積累和tau的過度磷酸化，最終促進(jìn)阿爾茨海默病（AD）的發(fā)展。ZHAO等［11］認(rèn)為，在大鼠腦梗死模型中，腦組織中MDA增加而SOD下降。因此，ROS、MDA與SOD的平衡被用來評估氧化應(yīng)激對腦損傷的影響。本研究結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)動物層面，ISO可以降低腦組織中的ROS、MDA并提高SOD；在細(xì)胞水平上，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由OGD/R所致ROS、MDA、LDH升高，可在被ISO處理后降低。此時(shí)，我們推測ISO對梗死腦組織的保護(hù)作用可與其抗氧化功能有關(guān)。此外，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)元凋亡的重要因素［12］。因此，我們認(rèn)為ISO可能參與了神經(jīng)元的增殖和凋亡過程，以減輕腦梗死的癥狀。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ISO處理能明顯抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)OGD/R誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞的活力，這表明ISO能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦梗死引起的氧化應(yīng)激損傷。此外，在損傷的腦組織中，氧化應(yīng)激常伴有神經(jīng)炎癥的發(fā)生。研究表明，促炎因子（如TNF-α、IL-6等）及抗炎因子（如IL-10）參與了腦梗死后炎癥調(diào)節(jié)過程［13］。本研究結(jié)果顯示，在血清、腦組織中，ISO抑制了TNF-α和IL-6的分泌，但促進(jìn)了IL-10的釋放，表明ISO可能是一種用于腦梗死治療的抗炎藥。

研究發(fā)現(xiàn)，在腦梗死的發(fā)生和發(fā)展中，NLRP3炎癥小體與神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)密切相關(guān)［14］。MILNER等［15］認(rèn)為，NLRP3炎癥小體可通過Aβ的積累和tau蛋白的過度磷酸化而被激活，從而觸發(fā)神經(jīng)炎癥，最終導(dǎo)致AD的認(rèn)知功能逐漸下降。YANG等［4］在NLRP3敲除小鼠中進(jìn)行MCAO再灌注實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)NLRP3可通過抑制IL-1β分泌以減少梗死區(qū)域，并減輕血腦屏障損傷。研究表明，NLRP3炎癥小體失活可降低腦損傷后氧化應(yīng)激水平，在腦缺血/再灌注損傷模型中注射NLRP3抑制劑MCC950可降低腦組織的過氧化作用［16-17］?；谏鲜鯥SO能抑制腦梗死后炎癥反應(yīng)的結(jié)果，我們推測ISO可能直接與NLRP3炎癥小體產(chǎn)生相互作用，調(diào)控腦梗死后炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在大鼠腦組織和神經(jīng)細(xì)胞中，ISO不僅抑制了NLRP3、ASC蛋白表達(dá)，還減少了IL-18和IL-1β的產(chǎn)生。為進(jìn)一步驗(yàn)證該假設(shè)，我們加入了NLRP3激動劑Nigericin進(jìn)行反饋驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Nigericin減輕了ISO處理對OGD/R誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞中NLRP3、ASC、IL-18、IL-1β表達(dá)的抑制作用，提示NLRP3炎癥小體是ISO治療腦梗死的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究揭示了ISO在腦梗死中對腦組織的保護(hù)作用，該作用與其調(diào)控NLRP3炎癥小體進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激和炎癥損傷有關(guān)。這提示ISO可能成為臨床治療腦梗死的潛在有效藥物，本研究為其臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。