沙利度胺灌胃對(duì)煙霧暴露致大鼠肺間質(zhì)纖維化合并肺氣腫的影響及其機(jī)制

魏會(huì)強(qiáng)，郭麗萍，侯彥琨，郝秀玲，馬志敏，柴永娜

1河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，石家莊 050060；

2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合心血管內(nèi)科

肺間質(zhì)纖維化合并肺氣腫（CPFE）是一種吸煙相關(guān)的間質(zhì)性肺疾病，屬于肺纖維化的一種特殊表型，CT影像表現(xiàn)為雙上葉肺氣腫和雙下葉肺纖維化［1］。一般認(rèn)為，肺氣腫和肺纖維化在臨床上是兩種不相關(guān)的疾病，但隨著胸部高分辨CT的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)許多吸煙患者同時(shí)伴有肺間質(zhì)纖維化和肺氣腫的影像改變，因此煙霧暴露是導(dǎo)致CPFE的主要危險(xiǎn)因素［2］。目前，臨床通常使用激素及免疫抑制劑治療CPFE。氫化可的松是從腎上腺皮質(zhì)中提取出的對(duì)糖類代謝具有較強(qiáng)作用的糖皮質(zhì)激素，是臨床治療CPFE的常用藥物，療效確切。但長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可能引發(fā)較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如肺部或機(jī)體其他部位發(fā)生細(xì)菌或真菌感染等。沙利度胺是一種谷氨酸衍生物，具有免疫抑制及抗血管生成等作用，近年來(lái)常被用于抗腫瘤治療，而關(guān)于其在CPFE中的治療作用鮮有報(bào)道。2020年7月—2021年12月，本研究通過(guò)煙霧暴露誘導(dǎo)小鼠CPFE，觀察沙利度胺在此過(guò)程中對(duì)CPFE的改善作用并分析其機(jī)制，希望可以為臨床治療CPFE提供新的治療方向及相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（210±10）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。沙利度胺溶液購(gòu)自常州制藥有限公司，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海巧伊生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、煙霧暴露組、沙利度胺組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組各30只。煙霧暴露組、沙利度胺組、陽(yáng)性藥物對(duì)照組分別置于自制的40 cm×50 cm×60 cm的有機(jī)玻璃容器內(nèi)，容器內(nèi)放入香煙進(jìn)行煙霧暴露（5支/次，2次/天），每次暴露在煙霧中的時(shí)間為1 h，共暴露30 d。沙利度胺組于煙霧暴露第1天用1%沙利度胺溶液（100 mg/kg）灌胃，每天1次；陽(yáng)性對(duì)照組于煙霧暴露第1天腹腔內(nèi)注射氫化可的松（80 mg/kg），每天1次。對(duì)照組置于相同容器內(nèi)，呼吸新鮮空氣。各組大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.3 肺組織病理觀察采用HE染色及Masson染色。于煙霧暴露第7、15、30天，分別取10只各組大鼠（沙利度胺組大鼠分別于煙霧暴露第5天及第17天各死亡2只）腹腔內(nèi)灌注麻醉藥物戊巴比妥鈉（50 mg/kg），通過(guò)股動(dòng)脈放血的方式處死，放血初收集血液待檢，處死后快速開(kāi)胸，取出右肺上葉及下葉，用4%多聚甲醛溶液固定，制成石蠟切片。HE染色：將制作好的石蠟切片脫蠟、透明、脫水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，伊紅染色，脫水、脫蠟液透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。Masson染色：將制作好的石蠟切片脫蠟、透明、脫水，蘇木素染色，酸性乙醇分化液分化，Masson藍(lán)化液返藍(lán)，品紅染液染色，苯胺藍(lán)液或綠液復(fù)染，脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.4 血清TGF-β1、VEGF和TNF-α水平檢測(cè)采用ELISA法。將從股動(dòng)脈收集的各組大鼠血液標(biāo)本在室溫凝固30 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清液分裝于試管內(nèi)，于-80℃冰箱內(nèi)保存。取各組-80℃冰箱保存的血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清TGF-β1、VEGF和TNF-α水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料通過(guò)Sample K-S進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以±s表示，組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行方差分析，不同時(shí)點(diǎn)測(cè)量數(shù)據(jù)比較行重復(fù)測(cè)量的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較

2.1.1 HE染色對(duì)照組大鼠肺泡腔結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無(wú)明顯炎癥及纖維化的呈現(xiàn)。煙霧暴露組大鼠在第7天時(shí)病變部位肺泡擴(kuò)張，肺泡間隔變窄，以上肺為甚，中下肺部分肺泡萎縮，肺泡間隔變厚，毛細(xì)血管再生明顯，呈簇狀聚集，肺泡間隔顯著增寬，肺泡內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞及炎癥細(xì)胞，其中炎癥細(xì)胞以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為甚，同時(shí)伴大量成纖維細(xì)胞滲出；第15天時(shí)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞減少，肺泡炎癥緩解，上葉部分肺泡持續(xù)擴(kuò)張有融合趨勢(shì)，擴(kuò)張肺泡可溶解成囊腫，下葉肺泡壁較前明顯增厚，成纖維細(xì)胞分化明顯，成纖維細(xì)胞大量增多，部分肺泡結(jié)構(gòu)逐漸消失，形成了更多的新毛細(xì)血管；第30天時(shí)可見(jiàn)肺大瘡與肺間質(zhì)纖維化交替存在，不過(guò)仍以上肺肺大瘡、下肺纖維化為甚，有局部淋巴細(xì)胞滲出，但炎癥反應(yīng)匱乏，血管缺如。沙利度胺組及陽(yáng)性藥物對(duì)照組在各時(shí)點(diǎn)肺組織病理改變與煙霧暴露組大體相同，但肺泡炎癥、纖維化及肺大瘡程度明顯減輕。見(jiàn)OSID碼圖1～3。

2.1.2 Masson染色對(duì)照組大鼠右下肺組織中細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)少許膠原纖維被染成藍(lán)色。煙霧暴露組在第7天時(shí)出現(xiàn)肺泡上皮損傷和上皮下基底膜破壞，成纖維細(xì)胞聚集，膠原蛋白沉積致纖維化，中、下肺部出現(xiàn)膠原纖維，可見(jiàn)少量染成藍(lán)色的膠原纖維；第15天時(shí)肺泡壁厚度增加，成纖維細(xì)胞聚集，部分肺泡結(jié)構(gòu)逐漸消失，形成纖維化及大量瘢痕組織，可見(jiàn)大量染藍(lán)的膠原纖維；30天時(shí)上肺大瘡較前變化不大，下肺可見(jiàn)大量肺泡壁破壞融合，呈蜂窩改變，可見(jiàn)大量密集的藍(lán)色膠原纖維。與煙霧暴露組比較，沙利度胺組和陽(yáng)性藥物對(duì)照組膠原含量均減少，肺大瘡嚴(yán)重程度減低。見(jiàn)OSID碼圖4～6。

2.2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較各組大鼠同時(shí)點(diǎn)血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較，煙霧暴露組＞陽(yáng)性藥物對(duì)照組、沙利度胺組＞對(duì)照組（P均＜0.05），沙利度胺組與陽(yáng)性藥物對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)TGF-β1、VEGF、TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，△P＜0.05；與模型組同時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05。

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3 討論

目前，CPFE的發(fā)病機(jī)制仍不明確，臨床觀察到CPFE常發(fā)于男性，且多數(shù)有吸煙史。大量臨床研究顯示，吸煙與肺氣腫及肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病相關(guān)，是肺氣腫及肺間質(zhì)纖維化的共同危險(xiǎn)因素。臨床上可見(jiàn)，有吸煙史的患者可同時(shí)出現(xiàn)肺氣腫和肺間質(zhì)纖維化的病理變化，其上肺主要表現(xiàn)為小葉中心性肺氣腫，下肺以尋常型間質(zhì)性肺炎為主要類型。煙霧吸入可趨化炎癥細(xì)菌入侵肺內(nèi)，并產(chǎn)生一定的炎癥反應(yīng)，損害肺泡組織，這在一方面可引起肺氣腫，另一方面又可能引發(fā)肺部間質(zhì)纖維化早期的炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生纖維化［2］。本研究通過(guò)將大鼠暴露于煙霧之中誘導(dǎo)小鼠CPFE，經(jīng)肺組織HE染色及Masson染色可見(jiàn)煙霧暴露組大鼠存在肺大瘡及肺纖維化，提示CPFE誘導(dǎo)成功。目前，激素及免疫抑制劑是臨床常用的CPFE的治療藥物。在肺氣腫及肺纖維化形成的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生大量炎癥因子及介質(zhì)，激素及免疫抑制劑在理論上均能抑制炎癥進(jìn)一步加重，從而阻斷病情惡化。本研究在誘導(dǎo)大鼠CPFE的過(guò)程中，分別用氫化可的松及沙利度胺干預(yù)，通過(guò)觀察肺組織病理學(xué)變化可見(jiàn)，與煙霧暴露組比較，陽(yáng)性藥物對(duì)照組及沙利度胺組肺部炎癥及肺大泡、肺纖維化程度明顯減輕；但陽(yáng)性藥物對(duì)照組與沙利度胺組比較病理緩解程度無(wú)明顯差異，提示氫化可的松及沙利度胺均可改善煙霧暴露誘導(dǎo)的小鼠CPFE。

肺泡巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞均能產(chǎn)生許多炎癥因子，這些炎癥因子在CPFE發(fā)生中起重要作用。研究顯示，TNF-α與肺間質(zhì)纖維化有著密切的關(guān)系，參與了纖維化的病理過(guò)程［3］。纖溶酶原激活物抑制物1（PAI-1）是一種單鏈糖蛋白，DING等［4］研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1能夠與TNF-α、TGFβ1等相互作用，促進(jìn)肺纖維化進(jìn)程。由上可見(jiàn)，TNF-α、TGF-β1在肺間質(zhì)纖維化形成中有著關(guān)鍵作用。有研究發(fā)現(xiàn)，吸煙肺氣腫患者早期血漿VEGF水平較不抽煙的正常人升高，而晚期則較不抽煙的正常人下降，提示VEGF與肺氣腫嚴(yán)重程度及煙霧暴露相關(guān)［5］。另外，VEGF對(duì)肺基質(zhì)玻璃纖維化的發(fā)生發(fā)展亦有影響。研究顯示，新生血管再生及聚集在肺纖維化形成中起著關(guān)鍵作用，而VEGF信號(hào)途徑在新生血管形成中起著重要的調(diào)控作用，因此也參與了纖維化的形成［6-7］。因此，TGF-β1、VEGF、TNF-α均與肺氣腫及肺間質(zhì)纖維化有著密切的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，煙霧暴露組血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平均顯著升高，提示煙霧作為肺氣腫、肺間質(zhì)纖維化形成的危險(xiǎn)因素，可能通過(guò)影響以上三種因子的變化來(lái)誘導(dǎo)CPFE。

血管內(nèi)皮細(xì)胞因子具有增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等作用，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞因子受體拮抗劑可誘導(dǎo)肺泡隔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而形成肺氣腫［9］。目前，CPFE尚無(wú)明確的治療手段，臨床中一般認(rèn)為免疫抑制劑及激素療效相對(duì)肯定［10-11］。在20世紀(jì)50年代，沙利度胺作為一種鎮(zhèn)靜藥物進(jìn)入市場(chǎng)，但后來(lái)因其嚴(yán)重的致畸形作用幾乎被全球禁用。然而，沙利度胺的作用并未被全盤否定，隨著對(duì)沙利度胺臨床應(yīng)用的深入研究，發(fā)現(xiàn)沙利度胺有很多積極的臨床作用，特別是在免疫、抗炎、抗血管生成中取得了令人鼓舞的結(jié)果。ZHAO等［12］及YE等［13］通過(guò)對(duì)動(dòng)物模型及臨床纖維化患者的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺對(duì)肺間質(zhì)纖維化有抑制作用。此外，多項(xiàng)研究表明，沙利度胺可通過(guò)下調(diào)TNF-α及TGF-β等炎癥細(xì)胞因子水平來(lái)減輕肺纖維化程度，進(jìn)而抑制纖維化［14-15］。糖皮質(zhì)激素治療肺間質(zhì)纖維化及肺氣腫的療效已在臨床中相對(duì)肯定，尤其是對(duì)肺氣腫療效更加可靠，但治療機(jī)制仍不是完全明確［16］。有些專家認(rèn)為，抑制炎癥反應(yīng)為主要途徑，本研究使用氫化可的松及沙利度胺干預(yù)煙霧暴露誘導(dǎo)的CPFE并觀察血清中TGF-β1、VEGF、TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性藥物對(duì)照組及沙利度胺組血清TGF-β1、VEGF、TNF-α水平與煙霧暴露組比較下降明顯，提示沙利度胺及氫化可的松可能通過(guò)抑制TGF-β1、VEGF、TNF-α的表達(dá)改善CPFE的肺組織病理，緩解CPFE進(jìn)展。

綜上所述，沙利度胺灌胃可減輕煙霧暴露所致大鼠CPFE，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1、VEGF、TNF-α水平，減輕炎癥反應(yīng)及抑制新生血管生成有關(guān)。本研究結(jié)果表明，沙利度胺及氫化可的松均可改善CPFE病理的惡化，但未對(duì)兩者聯(lián)合應(yīng)用的效果進(jìn)行觀察。有研究顯示，單獨(dú)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療肺間質(zhì)纖維化及肺氣腫效果不佳［17］。另有研究表明，激素聯(lián)合其他藥物治療能明顯緩解CPFE患者臨床癥狀，包括肺功能情況、血?dú)鉅顩r等，提示聯(lián)合治療在臨床癥狀改善上可能具有更好的效果［10，18］。沙利度胺因嚴(yán)重不良反應(yīng)一度被放棄使用于臨床，且其不良反應(yīng)與劑量呈正相關(guān)。因此在臨床應(yīng)用沙利度胺治療疾病時(shí)，一般都是聯(lián)合其他藥物應(yīng)用，以減少沙利度胺的使用劑量，盡量避免其不良反應(yīng)［19］。因此，我們擬在后續(xù)的研究中探討沙利度胺聯(lián)合氫化可的松對(duì)CPFE的改善作用是否優(yōu)于單藥，以降低藥物單獨(dú)使用的不良反應(yīng)，改善CPFE患者的預(yù)后，為臨床治療CPFE提供新的思路。