宮頸癌陰道灌洗液源外泌體差異表達(dá)miRNA篩選及其關(guān)鍵靶基因的生物信息學(xué)分析

呂單單，徐夢(mèng)偉，王磊，木葉斯?fàn)枴べI買提，林晨

1新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊8 300172；2新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

宮頸癌是發(fā)生在子宮陰道部及宮頸管的、女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，接受標(biāo)準(zhǔn)化治療的宮頸癌患者5年生存率約為80%，但是一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，其5年生存率將降至50%［1］。因此，宮頸癌的早期診斷和早期治療尤為重要。陰道分泌物由宮頸腺體分泌物等成分組成，可以反應(yīng)宮頸分泌物的改變，與血液比較，其臨床上收集無(wú)創(chuàng)且方便，受其他系統(tǒng)影響較小，因此從陰道分泌物中尋找診斷、治療、預(yù)后等分子標(biāo)志物是目前的研究熱點(diǎn)之一。外泌體是由多種細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡外小體，其可攜帶多種miRNA從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞中干擾基因表達(dá)，參與多種生物過(guò)程。2019年11月—12月，本研究通過(guò)超速離心法提取患者陰道灌洗液中的外泌體，分析宮頸癌患者陰道灌洗液源外泌體中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)差異表達(dá)miRNA序列對(duì)應(yīng)基因組DNA序列進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選出在宮頸癌中具有高度連通性的關(guān)鍵靶基因，以期為尋找宮頸癌的潛在生物標(biāo)志物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：XJYKDXR202208240102），選取于我院行手術(shù)治療的宮頸癌患者及同期接受體檢的宮頸炎志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌患者：經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌且未接受手術(shù)、放療或化療等治療；②宮頸炎患者：經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為宮頸炎；③近期沒(méi)有服用常規(guī)處方藥或避孕藥，沒(méi)有獻(xiàn)血及懷孕；④3個(gè)月內(nèi)沒(méi)有接種過(guò)疫苗；⑤患者及家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并慢性、感染性、自身免疫性疾?。虎诤喜⑦z傳性疾?。虎酆喜⑵渌愋湍[瘤。共選取符合標(biāo)準(zhǔn)的宮頸癌患者及宮頸炎患者各5例。

1.2 樣本采集及外泌體提取采集宮頸癌患者及宮頸炎患者陰道灌洗液，采集完成后立即放入液氮中轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。采用超速離心法提取外泌體。37℃水浴解凍樣本，冰上放置；4℃2 000 r/min離心10 min，留取上清；4℃10 000 r/min離心30 min，取上清；樣本轉(zhuǎn)移至超高速離心管中，4℃110 000 r/min離心75 min，棄上清；用1 mL 1×PBS重懸沉淀，重懸后各用1×PBS稀釋，0.22 μm膜過(guò)濾；樣本轉(zhuǎn)移至超高速離心管，4℃110 000 r/min離心75 min，棄上清；沉淀用相應(yīng)的1×PBS重懸，分裝，-80℃保存。

1.3 外泌體鑒定①形態(tài)觀察：采用透射電鏡（TEM）觀察外泌體形態(tài)。取外泌體凍存樣本，37℃水浴解凍。取10 μL滴于封口膜表面，夾取一片聚醋酸甲基乙烯—碳（Formvar-carbon）載樣銅網(wǎng)，將銅網(wǎng)Formvar膜面朝下放在懸液上輕蘸取適量外泌體懸液。在干燥環(huán)境中讓Formvar膜充分吸收5 min，使外泌體附著于Formvar膜表面。用0.75%二水合醋酸鈾酰染色5 min，并在PBS中漂洗3次，輕輕夾取銅網(wǎng)，將多余水分用吸水紙上吸干，于電鏡下觀察攝片。②粒徑大?。翰捎眉{米顆粒追蹤分析（NTA）鑒定外泌體粒徑大小。外泌體樣本水浴解凍后用PBS緩沖液稀釋至顆粒濃度108～109/mL，用移液槍向檢測(cè)槽注入1 mL稀釋的外泌體溶液，使用Nano ZS90粒徑儀進(jìn)行檢測(cè)并記錄分析數(shù)據(jù)。

1.4 宮頸癌外泌體差異表達(dá)miRNA篩選取宮頸癌患者及宮頸炎患者陰道灌洗液提取的外泌體樣本制作基因芯片（上海華盈生物醫(yī)藥科技有限公司）。對(duì)制作完成的基因芯片本身及芯片數(shù)據(jù)做質(zhì)量控制，芯片掃描圖上無(wú)物理劃傷，芯片掃描圖放大后能清晰顯示。芯片陣列名以及角落的黑白棋盤(pán)狀圖案，表示B2 Oligo強(qiáng)陽(yáng)性雜交質(zhì)控合格（OSID碼圖1）。采用R語(yǔ)言進(jìn)行宮頸癌外泌體差異表達(dá)miRNA分析，通過(guò)T-test計(jì)算得到P值。miRNA序列差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)按差異倍數(shù)＞2、組內(nèi)樣本數(shù)≥3時(shí)，P＜0.05進(jìn)行篩選；進(jìn)一步選出差異倍數(shù)前20的miRNA進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 差異表達(dá)miRNA靶基因GO生物功能與KEGG通路富集分析通過(guò)mirtarBase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)宮頸癌外泌體差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。通過(guò)R語(yǔ)言的clusterProfiler包對(duì)靶基因進(jìn)行GO生物功能、KEGG通路富集分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，選擇分析項(xiàng)目為生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分及信號(hào)通路。根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，篩選排名前40的生物過(guò)程及信號(hào)通路。

1.6 宮頸癌差異表達(dá)miRNA關(guān)鍵靶基因篩選運(yùn)用STRING10.5（https：//string-db.org/）在線工具選擇Multiple Proteins，物種選擇Home sapiens，對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。運(yùn)用Cytoscap3.8.0中的cytohubba插件對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出排名前20的具有高度連通性的樞紐靶基因。采用R語(yǔ)言對(duì)樞紐靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，與差異表達(dá)miRNA靶基因富集的KEGG信號(hào)通路取交集，篩選出共有的關(guān)鍵信號(hào)通路及與之相聯(lián)系的關(guān)鍵靶基因。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果TEM可觀察到清晰的囊泡結(jié)構(gòu)，呈雙層囊膜、茶托型或一側(cè)凹陷的半球形，為典型的外泌體形態(tài)。NTA顯示，樣本粒徑大小均符合外泌體的粒徑標(biāo)準(zhǔn)（30～190 nm）。見(jiàn)OSID碼圖2、3。

2.2 宮頸癌外泌體差異表達(dá)miRNA篩選結(jié)果宮頸癌陰道灌洗液源外泌體中顯著差異表達(dá)的miRNA共有84個(gè)，其中上調(diào)71個(gè)、下調(diào)13個(gè)。差異倍數(shù)前20的miRNA中上調(diào)18個(gè)、下調(diào)2個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌外泌體差異表達(dá)miRNA篩選結(jié)果

2.3 差異表達(dá)miRNA靶基因GO生物功能與KEGG通路富集分析結(jié)果通過(guò)mirtarBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與差異表達(dá)miRNA相關(guān)的273個(gè)靶基因。GO生物功能分析顯示，差異表達(dá)miRNA靶基因主要分布于細(xì)胞黏附斑、細(xì)胞—基質(zhì)黏附結(jié)點(diǎn)、細(xì)胞—基質(zhì)結(jié)點(diǎn)等，主要富集的生物過(guò)程為角蛋白結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素類蛋白連接酶結(jié)合等，主要富集的分子功能為核糖核蛋白復(fù)合物的生物生成、病毒基因表達(dá)、病毒轉(zhuǎn)錄等。KEGG信號(hào)通路分析顯示，差異表達(dá)miRNA靶基因主要富集的信號(hào)通路為癌癥中的蛋白聚糖、細(xì)胞衰老、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路等。見(jiàn)OSID碼圖4、5。

2.4 宮頸癌差異表達(dá)miRNA關(guān)鍵靶基因篩選結(jié)果宮頸癌中具有高度連通性的樞紐靶基因分別為FGF2、PDGFRB、PIK3R1、NRAS、IGF1R、MAPK14、AGO1、ITGB3、BCL2L1、H2AFX、AGO4、TNRC6B、SOCS1、FRS2、TGFBR1、EDN1、THBS1、CDKN1B、BCL2L11、ZNF217。見(jiàn)OSID碼 圖6、7。宮頸癌關(guān)鍵信號(hào)通路為AMPK信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、癌癥中的蛋白聚糖、TNF信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、PD-L1在腫瘤中的表達(dá)及PD-1檢測(cè)點(diǎn)通路，關(guān)鍵基因?yàn)镻IK3R1、EDN1、PDGFB、FGF2、IGF1R、THB1S、ITGB3、TGFBR1、NRAS、MAPK14。見(jiàn)表2。

表2 宮頸癌差異表達(dá)miRNA調(diào)控的關(guān)鍵信號(hào)通路及參與基因分析結(jié)果

3 討論

宮頸癌發(fā)病率有明顯的地區(qū)差異，新疆是宮頸癌高發(fā)地區(qū)，維吾爾族婦女宮頸癌的發(fā)病率居全國(guó)第一［2］。宮頸癌早期癥狀隱匿，許多患者發(fā)現(xiàn)癥狀就診時(shí)已為癌癥中晚期。因此，尋找新的宮頸癌生物標(biāo)志物以對(duì)宮頸癌和癌前病變進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)和治療，對(duì)降低宮頸癌發(fā)病率及病死率十分重要。

作為液體活檢領(lǐng)域“三大標(biāo)桿”之一的外泌體，被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊、疾病診斷和預(yù)后循環(huán)生物標(biāo)志物的重要載體。外泌體來(lái)源于細(xì)胞核內(nèi)，由多囊泡體內(nèi)陷腔化形成并通過(guò)多囊泡體與細(xì)胞膜融合而釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，廣泛存在于血清、血漿、唾液、尿液、腦脊液和乳液等多種體液中，主要通過(guò)與靶細(xì)胞的細(xì)胞膜融合以及胞吞作用等方式將其內(nèi)的miRNA、mRNA、lncRNA及蛋白質(zhì)等物質(zhì)傳遞到靶細(xì)胞內(nèi)，參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、腫瘤侵襲、抗原提呈等過(guò)程［3］。多項(xiàng)研究表明，細(xì)胞中的miRNA可以包裝在外泌體中并釋放，外泌體miRNA并非被動(dòng)釋放，而是在特定刺激下的選擇性分泌［4-5］。WU等［6］研究發(fā)現(xiàn)，血漿源外泌體miR-30d-5p和let-7d-3p是宮頸癌及其前體無(wú)創(chuàng)篩查的有價(jià)值的診斷生物標(biāo)志物。LIU等［7］發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者陰道灌洗液源外泌體中的miR-21和miR-146a上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者陰道灌洗液源外泌體中顯著差異表達(dá)的miRNA共有84個(gè)，其中上調(diào)71個(gè)、下調(diào)13個(gè)，包括miR-320d、miR-320c、miR-24-3p、miR-191-5p、let-7d-5p、let-7a-5p、miR-23b-3p等。CAMPOS-VIGURI等［8］研究顯示，miR-23b-3p是宮頸癌中的腫瘤抑制因子，并通過(guò)直接調(diào)節(jié)絡(luò)氨酸激酶c-Met參與人宮頸癌細(xì)胞C33A及CaSki的增殖、遷移和侵襲的調(diào)節(jié)。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-320c能夠通過(guò)靶向GABRP來(lái)抑制宮頸癌中的遷移潛能［9］。

我們進(jìn)一步對(duì)宮頸癌中差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行GO生物過(guò)程及KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、黏附及連接以及炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞活化、蛋白質(zhì)分解代謝等生物過(guò)程，并且能夠通過(guò)癌癥中的蛋白聚糖、細(xì)胞衰老、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路等影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。這提示宮頸癌源外泌體能夠通過(guò)參與炎癥及免疫的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究顯示，外泌體在腫瘤性炎癥微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用［10-11］。使用STRING對(duì)差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出宮頸癌中具與有高度連通性的關(guān)鍵靶基因，分別為FGF2、PDGFRB、PIK3R1、NRAS、IGF1R、MAPK14、AGO1、ITGB3、BCL2L1、H2AFX、AGO4、TNRC6B、SOCS1、FRS2、TGFBR1、EDN1、THBS1、CDKN1B、BCL2L11、ZNF217。有研究表明，半夏提取物能夠通過(guò)抑制SOCS1和激活下游JAK2-STAT1/STAT4/STAT5通路，恢復(fù)人宮頸腫瘤浸潤(rùn)性樹(shù)突狀細(xì)胞受損的功能［12］。WANG等［13］研究表明，miR-92a在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)負(fù)調(diào)控PIK3R1促進(jìn)宮頸癌惡性發(fā)展。

綜上所述，我們采集宮頸癌及宮頸炎患者的陰道灌洗液，通過(guò)超速離心法提取其中外泌體，發(fā)現(xiàn)宮頸癌中miR-320d、miR-320c、miR-24-3p、miR-191-5p、let-7d-5p等miRNA存在顯著差異表達(dá)，且PIK3R1、EDN1、PDGFB、FGF2、IGF1R、THB1S、ITGB3、TGFBR1、NRAS、MAPK14等靶基因在宮頸癌中具有關(guān)鍵作用，提示陰道分泌物外泌體miRNA作為宮頸癌無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物的可能性。由于外泌體含有眾多可以用來(lái)診斷疾病的分子載體，而且不需要常規(guī)活檢，故其在液體活檢方面有很大的前景。本研究采用超速離心法提取的外泌體中包含有非外泌體的囊泡，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可結(jié)合分子尺寸排阻色譜法或免疫親和捕獲技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定進(jìn)一步改進(jìn)。盡管關(guān)于外泌體的收集、分離和鑒定存在一定的難度，且大多研究還停留在對(duì)細(xì)胞表型的探索上，但隨著納米顆粒追蹤分析、免疫蛋白捕獲和高通量測(cè)序等技術(shù)的快速發(fā)展，外泌體分離和鑒定的效率也將不斷提高，其作為疾病的無(wú)創(chuàng)性新生物標(biāo)志物也隨之變?yōu)榭赡?。未?lái)可以通過(guò)大樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證進(jìn)一步證實(shí)外泌體中miRNA的差異表達(dá)情況，并構(gòu)建差異miRNA抑制和過(guò)表達(dá)的載體，尋找其細(xì)胞表型變化及相關(guān)信號(hào)通路，為進(jìn)一步探尋宮頸癌的分子標(biāo)志物提供新思路。