CACNA1D基因突變大鼠血壓變化及其與血漿Th1、Th2細(xì)胞因子的關(guān)系

吳小盈，陳慧，林鵬程，王歡，毛高偉

1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350001；2福建省立醫(yī)院心血管內(nèi)二科

高血壓是最常見的慢性病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與高血壓相關(guān)的基因多態(tài)性及其異常調(diào)控是研究的熱點(diǎn)。本課題組在前期高血壓家系調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了一個新的高血壓相關(guān)位點(diǎn)：CACNA1D基因c.920A＞G［1］。CACNA1D基因編碼Cav1.3鈣通道α1亞基，Cav1.3是L-型電壓門控鈣通道，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放，激素分泌及平滑肌收縮等多項(xiàng)生理功能［2-3］。據(jù)此，我們推測CACNA1D基因c.920A＞G很可能與高血壓發(fā)病有關(guān)。免疫系統(tǒng)激活在高血壓的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演了重要角色，其中T淋巴細(xì)胞功能及其分泌的細(xì)胞因子異常，尤其是兩種重要的輔助性T淋巴細(xì)胞亞群Th1、Th2之間的失衡可能與高血壓的靶器官損害有關(guān)［4-5］。Th1細(xì)胞合成和分泌白細(xì)胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ）等細(xì)胞因子，Th2細(xì)胞合成和分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子。Th1型和Th2型細(xì)胞因子在分別促進(jìn)自身增殖活化的同時抑制對方增殖活化，使機(jī)體維持Th1／Th2細(xì)胞功能平衡，避免發(fā)生免疫偏離或免疫功能紊亂。2018年6月—2021年6月，本研究應(yīng)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了與人CACNA1D基因?qū)?yīng)的點(diǎn)突變p.D307G（c.920A＞G）SD大鼠，觀察其血壓變化并分析這種變化是否與血漿Th1、Th2細(xì)胞因子有關(guān)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料實(shí)驗(yàn)動物：通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)建CACNA1D基因c.920A＞G突變SD大鼠（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）。采用PCR法鑒定F0代大鼠后，進(jìn)行序列分析并與野生型SD大鼠雜交，檢測種系傳播。取20日齡F1代大鼠部分鼠尾樣本，測序后進(jìn)行標(biāo)記。將上述2～4個月齡的雌性和雄性F1代雜合子大鼠在同一籠中飼養(yǎng)，繁殖F2代大鼠，對所有F2代大鼠基因型進(jìn)行鑒定（福州博尚生物有限公司）。分別抽取野生型（AA型）、雜合突變型（AG型）、純合突變型（GG型）SD大鼠14、22、12只，均雌雄各半，用于后續(xù)研究。大鼠飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲水、攝食，給予相同標(biāo)準(zhǔn)的動物飼料。動物實(shí)驗(yàn)遵從《中華人民共和國動物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例》并經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。儀器及試劑：SoftronTM智能無創(chuàng)血壓計BP-98A（北京軟隆科技有限責(zé)任公司），電子秤（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 ELISA反應(yīng)試劑盒（云南沃森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 血壓測量方法分別于F2代大鼠鼠齡第8、9、10、17、21、26、28、32周時通過SoftronTM智能無創(chuàng)血壓計采用尾袖法檢測大鼠的收縮壓，自動連續(xù)測量血壓3次，去除極值后取平均值。將32周時收縮壓≥140 mmHg的大鼠判定為高血壓大鼠，收縮壓＜140 mmHg的大鼠判定為正常血壓大鼠。

1.3 血漿Th1、Th2細(xì)胞因子水平檢測方法采用ELISA雙抗體夾心法。各基因型大鼠32周齡時，使用電子秤記錄大鼠體質(zhì)量，按0.5 mL/kg給予20%烏拉坦腹腔麻醉，使用一次性采血針行腹主動脈采血，快速注入抗凝管中，充分搖勻，3 000 r/min低溫離心10 min，取上層血漿置于-80℃冰箱中冷凍保存。使用相應(yīng)ELISA反應(yīng)試劑盒測定血漿Th1、Th2細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk法行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以±s表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三種基因型大鼠各時點(diǎn)收縮壓比較見圖1。

圖1 三種基因型大鼠收縮壓比較趨勢圖

2.2三種基因型大鼠32周齡時收縮壓比較32周齡時，AA型、AG型、GG型雄性大鼠收縮壓分別為（124.57±12.97）、（143.00±11.08）、（141.67±13.10）mmHg，雌性大鼠收縮壓分別為（121.67±15.36）、（139.80±14.33）、（138.17±9.20）mmHg；AG型、GG型大鼠收縮壓均高于同性別AA型大鼠（P均＜0.05），各基因型大鼠不同性別間收縮壓比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 三種基因型大鼠32周齡時血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較見表1。

表1 三種基因型大鼠32周齡時血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較（±s）

表1 三種基因型大鼠32周齡時血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較（±s）

注：M為雄性，F(xiàn)為雌性；與同性別AA型比較，*P＜0.05。

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2.4 高血壓與正常血壓大鼠血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較32周齡時，共有高血壓大鼠17例，收縮壓為（150.93±7.28）mmHg；正常血壓大鼠31例，收縮壓為（126.89±10.03）mmHg。高血壓與正常血壓大鼠血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較。見表2。

表2 高血壓與正常血壓大鼠血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較（±s）

表2 高血壓與正常血壓大鼠血漿IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ及IFN-γ/IL-4比較（±s）

注：與正常血壓大鼠比較，*P＜0.05。

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3 討論

各種原因造成的血管壁炎癥和損傷激活機(jī)體免疫反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管壁重構(gòu)，促使高血壓發(fā)生。應(yīng)用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體阻滯劑不僅能有效降低血壓，還可以通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)達(dá)到治療效果［6-7］。高血壓發(fā)病多基于遺傳因素和環(huán)境因素，目前較普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為其是一種在環(huán)境致病因素影響下的多基因關(guān)聯(lián)遺傳性疾病，超過一半的高血壓病患者存在高血壓病家族史。高血壓動物模型的應(yīng)用對于闡明高血壓發(fā)病機(jī)制，尤其是研究遺傳因素對高血壓發(fā)病的作用有非常重要的地位。

在本課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，CACNA1D基因c.920A＞G位點(diǎn)可能是一個新的高血壓相關(guān)位點(diǎn)。在我們調(diào)查的高血壓家系中，先證者為29歲女性，其11名家庭成員中有10名攜帶CACNA1D基因雜合錯義突變，8名成年攜帶者中6名患有慢性高血壓，其中包括先證者的雙胞胎姐妹［1］。CACNA1D基因是編碼L型鈣通道ɑ1亞單位家族的一員，研究顯示其可能是一個新的高血壓相關(guān)區(qū)域［8］。L型鈣通道是三類電壓門控鈣離子通道之一，在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變血管平滑肌的收縮及舒張，從而調(diào)節(jié)血壓［9］。LU等［10］在中國成人中發(fā)現(xiàn)CACNA1D（rs9810888）基因與血壓相關(guān)，YANG等［11］研究發(fā)現(xiàn)CACNA1D（rs9810888）GG基因型和不良生活方式對中國兒童血壓升高有聯(lián)合效應(yīng)。以上研究均提示，CACNA1D基因可能和血壓調(diào)節(jié)有關(guān)并可能是L型鈣通道阻滯劑降壓作用的靶點(diǎn)。

本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建了CACNA1D基因c.920A＞G單位點(diǎn)突變的SD大鼠（專利號：No.202011326345.8），并對其F2代大鼠進(jìn)行了32周的血壓監(jiān)測。結(jié)果顯示，與野生型比較，突變型大鼠自10周齡后收縮壓出現(xiàn)隨時間逐步升高的趨勢，到28～32周齡時，血壓顯著高于野生型大鼠。32周齡大鼠對應(yīng)的人類年齡大致為22歲，此時突變型大鼠平均收縮壓大致相當(dāng)于人類1級高血壓的血壓水平。這提示CACNA1D基因c.920A＞G單位點(diǎn)突變可能導(dǎo)致大鼠發(fā)生高血壓。

高血壓免疫機(jī)制相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞及其分泌的免疫活性物質(zhì)和高血壓的發(fā)病及其靶器官損害存在密切關(guān)系［5］。Th1和Th2是兩個重要的輔助性T淋巴細(xì)胞亞群，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對于AngⅡ誘導(dǎo)的血壓升高、血管炎癥和血管功能障礙有促進(jìn)作用。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2及IFN-γ，高血壓患者中IFN-γ水平升高，且和血壓分級呈正相關(guān)。SALEH等［12］研究發(fā)現(xiàn)，敲除IFN-γ基因可抑制小鼠AngⅡ誘導(dǎo)的近端小管鈉重吸收，從而降低AngⅡ誘發(fā)的高血壓。本研究結(jié)果顯示，CACNA1D基因突變的雄性大鼠IFN-γ水平顯著高于野生型大鼠，高血壓大鼠IFN-γ水平雖然高于正常血壓大鼠，但沒有有統(tǒng)計學(xué)意義，提示CACNA1D基因c.920A＞G突變導(dǎo)致的高血壓可能與Th1細(xì)胞功能異常有關(guān)。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，正常情況下，Th1和Th2細(xì)胞因子相互作用，處于動態(tài)平衡。當(dāng)機(jī)體在炎癥因子的刺激下出現(xiàn)Th0細(xì)胞向Th1和Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化時，作為Th1和Th2細(xì)胞分泌的代表性細(xì)胞因子，IFN-γ和IL-4起到了重要的調(diào)節(jié)作用，分別促進(jìn)自身細(xì)胞的分化成熟并抑制對方細(xì)胞的分化成熟。有研究發(fā)現(xiàn)，高血壓伴左心室肥厚患者Th1細(xì)胞比例明顯升高，Th1/Th2細(xì)胞比值大于單純高血壓組和對照組［13］。IFN-γ/IL-4可以反映機(jī)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞的情況，本研究中AG型雜合突變雄性大鼠血漿IFN-γ/IL-4細(xì)高于野生型大鼠，高血壓組大鼠IL-4低于、IFN-γ/IL-4高于正常血壓大鼠。這提示CACNA1D基因c.920A＞G突變大鼠模型中，高血壓的發(fā)生可能與Th1/Th2細(xì)胞失衡有關(guān)。

在CACNA1D基因突變的雌性大鼠中，未觀察到IFN-γ或IFN-γ/IL-4與野生型之間的差異，考慮原因有二。①可能與高血壓的性別差異有關(guān)。劉欣［14］對人重組激活基因1（Rag-1）敲除小鼠進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，將雄性C57小鼠的CD3+T淋巴細(xì)胞移植給Rag-1敲除小鼠，給予AngⅡ干預(yù)后，雄性Rag-1敲除小鼠的血壓明顯高于雌性Rag-1敲除小鼠。同時，對于雄性Rag-1敲除小鼠，接受雄性C57小鼠的CD3+T淋巴細(xì)胞移植，給予AngⅡ干預(yù)后，其血漿IL-17A和腫瘤壞死因子TNF明顯高于、血漿IL-10明顯低于接受雌性C57小鼠的CD3+T淋巴細(xì)胞移植者。這提示高血壓及其相關(guān)T淋巴細(xì)胞分化可能存在性別差異。②可能與本實(shí)驗(yàn)大鼠高血壓病程較短有關(guān)。本研究中，實(shí)驗(yàn)大鼠32周齡相當(dāng)于人類22歲，血壓水平相當(dāng)于1級高血壓，處于早發(fā)高血壓的早期階段；并且本實(shí)驗(yàn)中雌性GG型大鼠平均血壓為138 mmHg，略低于140 mmHg。這些可能是造成在雌性大鼠中未觀察到IFN-γ或IFN-γ/IL-4與野生型之間差異的原因。

綜上所述，本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)建了CACNA1D基因c.920A＞G單位點(diǎn)突變的SD大鼠，發(fā)現(xiàn)純合及雜合的突變大鼠血壓高于未發(fā)生突變的野生型大鼠，其高血壓的發(fā)生可能與Th1/Th2細(xì)胞功能失衡有關(guān)。