miR-145過表達對缺氧誘導心肌細胞焦亡的抑制作用及其機制

浦湧，崔勝宇，吳浩亮，陶波，孟祥平，夏豪，徐林

1武漢經濟技術開發(fā)區(qū)（漢南區(qū)）人民醫(yī)院武漢大學人民醫(yī)院漢南醫(yī)院心內科，武漢 430090；

2武漢大學人民醫(yī)院武漢大學心血管病研究所心血管病湖北省重點實驗室心內科；

3武漢市第四醫(yī)院老年醫(yī)學科

微小RNA（miRNA）是一種小的非編碼RNA，可與相關靶基因的3'-非翻譯區(qū)結合，對靶基因產生負調控作用［1］。miRNA廣泛參與細胞增殖［2］、凋亡［3］、分化［4］等生理或病理過程，在細胞內具有重要的調控作用。作為miRNA的一種，miR-145已被證明對心血管疾病具有至關重要的影響。焦亡是細胞程序性死亡的一種類型，其在各種心血管疾病的發(fā)病中起著關鍵作用，可發(fā)生于心肌梗死［5］、心肌缺血再灌注損傷［6］、動脈粥樣硬化［7］、心力衰竭［8］等疾病中。焦亡同凋亡類似，是一個高度調控的細胞死亡過程，通過多種方式干預抑制這一過程在許多條件下具有心臟保護作用。炎癥小體的激活、Caspase-1的活性轉化、活性氧（ROS）表達增加以及OD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、（IL-1β）、（IL-18）等炎癥因子的高表達是細胞焦亡發(fā)生的關鍵特征［9］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-145能夠靶向負調控鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ），進而調控其下游分子核轉錄因子κB（NF-κB）［10］，且NF-κB信號的激活可進一步調控NLRP3的激活［11］。由于miR-145對心血管疾病具有的潛在保護作用，并且焦亡也發(fā)生于心肌細胞的損傷過程中，因此有必要研究miR-145是否可能通過對心肌細胞焦亡的調控發(fā)揮對心肌細胞的保護作用，同時是否通過CaMKⅡ/NF-κB信號通路影響心肌細胞焦亡。2022年1月—6月，本研究通過缺氧誘導心肌細胞損傷，觀察miR-145過表達對心肌細胞焦亡的影響并分析其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料大鼠心肌細胞系H9C2購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清購自美國BIOEXPLORER Life Science公司，高糖培養(yǎng)基購自美國Cytiva公司，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，過表達miR-145腺病毒及其陰性對照病毒購自上海吉凱公司。超氧陰離子檢測試劑（活性氧檢測試劑）購自碧云天生物公司，逆轉錄-PCR試劑盒購自賽維爾生物科技公司，AnnexinV-PE/7-AAD凋亡染色試劑盒購自美國BD公司。磷酸化CaMKⅡ（p-CaMKⅡ）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、GAPDH抗體均購自美國CST公司，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18山羊抗兔及山羊抗小鼠抗體購自上海艾比瑪特生物醫(yī)藥公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組H9C2細胞置于含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達70%～80%時，分為正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組。

1.2.2 細胞miR-145腺病毒感染及缺氧誘導缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組分別使用腺病毒包裝的miR-145及腺病毒包裝的陰性對照序列與細胞共孵育6 h后換液，病毒感染復數(shù)（MOI）=50；正常組、缺氧組不做miR-145腺病毒感染處理。24 h后將缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞轉移至缺氧培養(yǎng)箱（1%氧氣濃度）中培養(yǎng)，正常組不做缺氧處理，24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 細胞miR-145 mRNA表達檢測采用實時熒光定量PCR法。收集各組細胞，按照試劑盒說明常規(guī)提取總RNA，而后逆轉錄為cDNA，以此為模板，按照實時熒光定量PCR的說明書進行熒光定量PCR。循環(huán)條件：95℃10 min，95℃15 s、60℃30 s，共完成40個循環(huán)。引物序列：miR-145-5p上游為5′-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′，下 游 為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC-3′；U6上游為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內參，按照用2－ΔΔCt計算各組miR-145的相對表達量。

1.2.4 細胞ROS水平檢測采用超氧化物陰離子探針（碧云天，S0063）。使用終濃度為2.5 μmol/L的超氧化物陰離子探針和細胞一起在37℃孵育30 min進行熒光探針裝載，PBS洗滌后，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 細胞焦亡情況觀察采用TUNEL染色及流式細胞術。TUNEL染色：將各組細胞與TUNEL反應液在37℃黑暗條件下孵育90 min，用熒光顯微鏡記錄并拍照，計數(shù)TUNEL陽性細胞以反映心肌細胞焦亡情況。TUNEL陽性率=TUNEL陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。流式細胞術：取各組細胞，收集原培養(yǎng)液，PBS洗后加入胰酶消化1～3 min后終止消化，用移液槍吹打成單個細胞與上清液混勻，1 000 r/min離心5 min，去上清，PBS漂洗，1 000 r/min離 心5 min，去上清。加入100 μL 1X Annexin Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-PE，加入5 μL 7-AAD，室溫避光15 min，上機前補加400 μL 1X Binding Buffer，上流式細胞儀檢測各組細胞死亡率。

1.2.6 細胞中焦亡相關因子表達檢測采用免疫組織化學及實時熒光定量PCR法。采用免疫組化法檢測NLRP3蛋白表達：細胞樣本在4%多聚甲醛固定后，使用內源性過氧化物酶阻斷劑孵育20 min，后漂洗3次，使用3%BSA封閉樣本3 min后，滴加配置好的NLRP3一抗液體孵育過夜。第2天將玻片孵育二抗后，使用DAB顯色，復染細胞核封片后在光鏡下拍照，觀察NLRP3蛋白表達情況。采用實時熒光定量PCR法檢測NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達：方法同“1.2.3”，循環(huán)條件：95℃30 s，95℃15 s、60℃10 s，共完成40個循環(huán)。引物序列：NLPR3上游 為5′-AGCTGCTCTTTGAGCCTGAG-3′，下 游 為5′-TCTGCTAGGCTCTTTGGTGC-3′；IL-1β上 游 為5′-TCGTGCTGTCTGACCCATGT-3′，下 游 為5′-ACAAAGCTCATGGAGAATACCACTT-3′；IL-18上游為5′-ACGGAGCATAAATGACCAAGTTC-3′，下游為5′-TCTGGGATTCGTTGGCTGTT-3′；GAPDH上游為5′-CCAAGGTCATCCATGACAACTT-3′，下游為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3′。以GAPDH為 內參，按 照 用2－ΔΔCt計 算 各 組NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA的相對表達量。

1.2.7 細胞中CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達檢測采用Western blotting法。取各組細胞在裂解緩沖液中裂解得到總蛋白，通過凝膠電泳分離轉移到PVDF膜上。在5%的脫脂牛奶中封閉60 min后，在4℃與p-CaMKⅡ、p-NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18及GAPDH抗體孵育過夜。第二天使用緩沖液洗膜后，在室溫下與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗或抗小鼠二抗孵育1 h。利用增強型化學光檢測試劑對蛋白條帶進行可視化，利用Image J軟件分析條帶灰度值。以GAPDH作為內源性對照，以目的條帶與對照條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk方法行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞miR-145 mRNA表達比較正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞miR-145 mRNA相對表達量分別為（1.00±0.10）、（0.62±0.05）、（6.43±0.40）、（0.59±0.14），細胞miR-145 mRNA相對表達量缺氧+miR-145組＞正常組＞缺氧組、缺氧+陰性對照組（P均＜0.05）。

2.2 各組細胞ROS水平比較正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞ROS水平分 別 為（1.04±0.09）、（3.00±0.20）、（1.61±0.17）、（3.25±0.23），細胞ROS水平缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。

2.3 各組細胞中焦亡情況比較TUNEL染色顯示，正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞TUNEL陽性率分別為（14.33±4.04）、（60.00±3.00）、（45.00±3.00）、（65.00±2.29）；流式細胞術檢測顯示，正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞死亡率分別為（4.30±0.26）、（14.33±0.44）、（9.20±0.51）、（14.46±0.35）；細胞TUNEL陽性率、死亡率缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。

2.4 各組細胞中焦亡相關因子表達比較免疫組化染色顯示，正常組、缺氧組、缺氧+miR-145組、缺氧+陰性對照組細胞NLRP3蛋白表達分別為（1.00±0.20）、（5.43±0.21）、（2.70±0.26）、（5.73±0.21），細胞NLRP3蛋白表達缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。實時熒光定量PCR顯示，NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達比較（±s）

表1 各組NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與缺氧組比較，#P＜0.05。

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2.5 各組中CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較細胞p-CaMKⅡ、p-NF-κB、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達缺氧組、缺氧+陰性對照組＞缺氧+miR-145組＞正常組（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

表2 各組CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與缺氧組比較，#P＜0.05。

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3 討論

心肌梗死是一種嚴重的冠狀動脈相關疾病，主要由冠狀動脈粥樣硬化血栓形成或多種原因造成心肌氧供失衡、心肌細胞損傷導致。動脈粥樣硬化斑塊被破壞后，引起血小板聚集，導致冠狀動脈阻塞，心肌缺血缺氧壞死。研究表明，梗死的心肌及缺血缺氧的心肌均伴隨細胞焦亡，發(fā)生梗死的心肌細胞中NLRP3、IL-1β、IL-18等炎癥細胞因子水平普遍升高，而施加干預對NLRP3炎癥小體抑制后，可以減少心肌焦亡，從而有效改善缺血缺氧誘導的心肌損傷［12］。miR-145定位于染色體5q32-33，長度約為4.08 kb，已被證明在多種心血管疾病中有著積極影響，并且可在心肌梗死相關損傷中發(fā)揮重要的調控作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在遭受缺氧的H9C2心肌細胞中，miR-145表達顯著下調，這與LIU等［13］研究結果一致。而通過miR-145腺病毒感染H9C2細胞，發(fā)現(xiàn)細胞中miR-145表達顯著上調，提示成功建立過表達miR-145的腺病毒感染細胞。

研究顯示，在缺血缺氧的心肌中，過度的炎癥、氧化應激水平會加重心肌細胞損傷［10］。我們在研究中檢測了各組細胞內的ROS水平，發(fā)現(xiàn)缺氧組及缺氧+陰性對照組細胞內ROS水平較正常組均明顯升高，而缺氧+miR-145組細胞內ROS水平較缺氧組及缺氧+陰性對照組明顯下降，提示miR-145過表達的缺氧心肌細胞內ROS水平降低，氧化應激水平得到明顯改善。

細胞焦亡是與炎癥密切相關的程序性死亡，我們在研究中進一步檢測了細胞焦亡相關情況，發(fā)現(xiàn)經過缺氧誘導的細胞TUNEL陽性率、流式細胞術檢測的細胞死亡率均高于正常組，而在過表達miR-145的細胞中，細胞TUNEL陽性率、死亡率較缺氧組及缺氧+陰性對照組均有明顯改善。此外，我們還對焦亡發(fā)生的特征性指標NLRP3蛋白進行了免疫組化染色，并且對焦亡相關效應分子NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA進行了實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在缺氧+miR-145組中，NLRP3、IL-1β、IL-18表達均低于缺氧組及缺氧+陰性對照組，提示在心肌細胞中過表達miR-145可減輕缺氧引起的細胞焦亡。

ROS可激活CaMKⅡ信號進而加重心肌細胞損傷，并且miR-145被發(fā)現(xiàn)可通過對CaMKⅡ的靶向負調控發(fā)揮調控其下游信號的作用［13-14］。CaMKⅡ是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，廣泛參與細胞鈣信號轉導、細胞存活、細胞增殖以及細胞炎癥或氧化應激反應［15-16］。目前，關于CaMKⅡ對細胞焦亡過程影響的報道較少，但CaMKⅡ在細胞焦亡過程中的可能作用仍可從以往的相關研究中推測。SUETOMI等［17］發(fā)現(xiàn)，心肌細胞中缺失CaMKⅡ可降低壓力過載誘導的心功能障礙和心臟炎癥水平，這種保護作用可能與缺失CaMKⅡ抑制了NF-κB及NLRP3的激活有關。此外，一項關于CaMKⅡ介導膠質母細胞瘤細胞中焦亡的研究顯示，Caspase家族及GSDME主要參與了CaMKⅡ介導的焦亡［18］。NFκB信號可作為CaMKⅡ的下游分子發(fā)揮作用［19］，并且有研究報道，激活的NF-κB信號可進一步調控NLRP3的激活［11］。本研究采用Western blotting法檢測了CaMKⅡ/NF-κB信號通路相關蛋白表達，發(fā)現(xiàn)在過表達miR-145的心肌細胞中，由缺氧引起的過度激活的CaMKⅡ信號被抑制，具體表現(xiàn)為p-CaMKⅡ較缺氧+陰性對照組顯著下調。此外，我們通過觀察NF-κB及其下游的NLRP3介導的焦亡信號通路發(fā)現(xiàn)，在缺氧及缺氧+陰性對照組中，CaMKⅡ/NF-κB信號通路及其下游的焦亡指標NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18均被激活；而在缺氧+miR-145組中，這些指標均有了顯著改善。以上結果提示，miR-145可以緩解ROS的產生，并且可抑制CaMKⅡ的活性進而降低p-NF-κB水平，影響NF-κB核轉位，這一級聯(lián)效應使焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達受到抑制，最終減輕了心肌細胞焦亡。

綜上所述，本研究通過miR-145腺病毒感染心肌細胞系H9C2并對其進行缺氧誘導，發(fā)現(xiàn)miR-145可通過對CaMKⅡ/NF-κB信號通路的抑制來發(fā)揮對心肌細胞的抗焦亡作用，進而保護缺氧引起的心肌細胞損傷。盡管miR-145在心血管疾病中的保護作用已被廣泛證實，但其對焦亡的調控作用尚未見報道，本研究或可為心肌損傷今后可能的靶向治療以及miR-145的生物學功能提供新的見解。