黃化茶樹黃金菊的葉綠體結構透射電鏡觀察

江新鳳，李 琛，曹揮華，王治會，江和源，董春旺，倪德江，童忠飛*

（1.江西省經(jīng)濟作物研究所/江西省茶葉質量與安全控制重點實驗室，江西 南昌 330043；2.中國農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；3.華中農(nóng)業(yè)大學 園藝林學學院，湖北 武漢 430070）

黃金菊是江西省選育的特異性茶樹資源［1］，來源于修水縣寧州群體，與已經(jīng)鑒定的國家良種寧州2號同屬一類，為寧州群體種中表現(xiàn)優(yōu)異的單株選育而來。尚未經(jīng)過國家審（鑒、認）定，也未進行品種登記，該品種在江西種植面積較大［2］，許多茶樹新品系的選育均以該品系為母本或父本，該資源特色鮮明，但在全國范圍內(nèi)受到的關注很少，目前對于這一品種新梢黃化形成的機理尚未完全清楚［3］。江新鳳等［4］在2021年對茶樹資源黃金菊開展了植物學特性、適應性、適制性等方面的研究，探究了黃金菊茶樹新梢黃化的生理、生化和分子機理，為江西茶樹種質資源的選育提供了重要的數(shù)據(jù)資料，為光敏黃化品種栽培、種植等提供了理論基礎。前人對其他作物研究表明，作物芽葉黃化通常與葉綠素合成受阻有關［5-10］。也有研究發(fā)現(xiàn)茶樹白化性狀中葉綠體結構變化較大［11-13］（圖1）。茶樹黃金菊在正常光照情況下，待嫩梢成熟，葉色與寧州2號葉色無異，那么，黃金菊黃化的機理到底怎么樣？其萌發(fā)過程中哪些亞細胞結構發(fā)生了變化？關于這些問題的研究鮮見報道。本文以寧州2號為對照，對黃化茶樹黃金菊進行80%遮蔭處理，待黃化茶樹轉為接近對照品種葉片葉色時，對各試驗處理進行了葉綠素、SPAD值以及亞細胞透視電鏡的觀察，以期進一步揭示黃化茶樹黃金菊的黃化機理。

圖1 黃金菊芽葉萌發(fā)

1 材料與方法

1.1 試驗地

試驗茶樹種植區(qū)域位于115°59′45.3″E，28°22′3.4″N，海拔50～55 m。該區(qū)域茶園土壤為紅壤土，2017年測得茶園土壤pH值為4.06，有機質19.70 g/kg，全氮1137.00 mg/kg，全磷0.63 g/kg，全鉀14.22 g/kg，水解性氮100.20 mg/kg，有效磷50.50 mg/kg，速效鉀169.00 mg/kg，交換性鎂0.42 mmol/kg，交換性鈣1.20 mmol/kg。

1.2 試驗茶樹及取樣

以黃金菊為研究材料，寧州2號為對照品種，試驗茶樹樹齡均為20周年，長勢良好。2018年4月10日開始對黃金菊茶樹進行遮蔭處理，遮蔭措施：于茶行邊每隔3 m駐直徑20 mm鋼管，離地面高1.8 m，處理長度15 m，寬6 m，于頂部及周邊垂直到地面覆蓋遮光率80%的遮蔭網(wǎng)（用2層4針黑色遮陽網(wǎng)覆蓋），定期觀測黃金菊自然光照處理（NS）、遮蔭處理（S）和對照品種寧州2號（CK）的表型性狀。2018年6月10日，各試驗處理間產(chǎn)生明顯

表型性狀變化，按茶樹組織超微結構取樣要求，采摘茶樹品種自然光照黃金菊、遮蔭處理黃金菊、對照品種寧州2號的第2葉、第4葉，送至中國科學院武漢病毒研究所進行TEM電鏡檢測，同時采用葉綠素儀分別測定各處理SPAD值（n=100），并測定各處理的葉綠素a、葉綠素b等成分含量。

1.3 測定方法

1.3.1 葉綠素含量測定 稱取0.2 g茶樹鮮葉（去梗去主脈），剪碎放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉，3 mL 5%乙醇，充分研磨成勻漿，再加入10 mL乙醇，充分研磨直至組織變白。避光，靜置5 min后過濾到25 mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至25 mL，搖勻。以95%乙醇為空白，分別在波長663、645、470 nm下測定吸光度［13］。

葉綠素a含量（Chla）、葉綠素b含量（Chlb）、類胡蘿卜素含量（Car）的計算公式為：

式中，m為葉片質量（g）。

1.3.2 透射電鏡觀察 樣品處理參照Wei等［14］的研究方法。待樣品包埋好后，用EM UC7（德國Leica公司生產(chǎn)）超薄切片機切成60～100 nm的切片，鉛和鈾雙染色后在Tecnai G220 TWIN （美國FEI公司生產(chǎn)）電鏡下面觀察。

2 結果與分析

2.1 黃金菊遮蔭前后表型變化及葉綠素相對含量比較

相比較于寧州2號，黃金菊春季茶芽逐漸萌發(fā)，芽為橙紅色，第1葉為淺紫色，第2葉呈現(xiàn)部分黃色。盛夏階段，隨著光照強度的加強，黃金菊的黃白色芽葉表型充分發(fā)展，這種現(xiàn)象在以往對黃金菊研究中已有報道［1-4］，但是由于光照太強，有些幼齡茶樹嫩梢容易出現(xiàn)灼傷等現(xiàn)象，成齡茶樹或試驗茶樹及綠葉、對照茶樹、遮蔭茶樹均會出現(xiàn)如此現(xiàn)象。至秋冬季節(jié)，黃金菊茶樹呈現(xiàn)返綠現(xiàn)象。隨著嫩梢成熟，先從嫩梢下部葉片開始返綠，自下而上葉片逐步由淺綠色返回到深綠色。通過在高于茶樹樹冠30～40 cm處覆蓋80%黑色遮蔭網(wǎng)，從而實現(xiàn)對茶樹黃金菊的遮光處理，遮蔭后黃金菊的表型性狀的變化（圖1）。結果表明，遮蔭后黃金菊茶樹新梢不會呈現(xiàn)自然光照下顏色變化的3個階段，該試驗也能證明，黃金菊茶樹也屬于光照敏感性茶樹資源。

圖2 遮蔭處理后茶樹的芽、葉等生長情況

由表1可知，遮蔭后黃金菊第2葉的Chla含量、Chlb含量、類胡蘿卜素含量、SPAD值分別為0.89 mg/g、0.23 mg/g、475.51 mg/g、31.24，比自然生長黃金菊的各指標分別提高了102.27%、155.56%、38.01%、58.90%，遮蔭后色素含量呈現(xiàn)出顯著性變化趨勢（P＜0.05），SPAD值提高了59.08%。遮蔭處理的Chla含量、Chlb含量、類胡蘿卜素、SPAD值與對照品種寧州2號的差異顯著（P＜0.05）。對照品種寧州2號的Chla含量、Chlb含量、類胡蘿卜含量、SPAD值分別比遮蔭處理提高了71.91%、130.43%、68.34%、48.43%?？梢娬谑a后黃金菊第2葉復綠過程中，葉綠素等物質代謝明顯，但未達到寧州2號的綠化水平。

表1 試驗茶樹第2葉色素含量變化情況

由表2可知，遮蔭處理第4葉的Chla含量、Chlb含 量、Car含 量、SPAD值 分 別 為1.99 mg/g、1.04 mg/g、936.12 mg/g、54.32，比自然生長黃金菊的各指標分別提高了36.30%、33.33%、11.74%、31.91%。遮蔭處理的Car含量、SPAD值與自然光照處理的有顯著性差異（P＜0.05），Chla、Chlb含量在遮蔭后有提高，但差異不明顯。寧州2號的Chla含量、Chlb含量、Car含量、SPAD值分別與遮蔭處理的相差不大，且組間無顯著性差異。可見在遮蔭后黃金菊第4葉復綠過程中，葉綠素等物質代謝迅速，與寧州2號第4葉綠化水平無異。

表2 試驗茶樹第4葉色素含量變化情況

2.2 遮蔭對黃金菊葉綠體結構的影響

生長環(huán)境尤其是光照強度對新梢芽葉的顏色起到?jīng)Q定性的作用，當對自然生長的茶樹黃金菊進行遮蔭處理后，其新梢伸展發(fā)育成熟，葉片黃化程度逐漸減輕，綠色逐漸加重。取黃金菊成熟葉片（不同葉位）去葉脈的植物組織，經(jīng)制樣后置于TecnaiG220 TWIN透射電鏡下觀察葉片組織的葉綠體結構，結果如圖3、圖4所示。對照品種寧州2號、遮蔭處理的黃金菊的第2葉、第4葉有典型細胞、線粒體和葉綠體結構，近橢圓形或者圓形的葉綠體貼細胞壁生長于細胞內(nèi)，葉綠體內(nèi)具有類囊體、嗜鋨顆粒以及緊密堆疊而成的基粒；而自然光照條件下黃金菊的第2葉、第4葉中葉綠體具有類囊體、嗜鋨顆粒和基粒，但是緊密堆疊的基粒片數(shù)量較少，葉綠體和細胞有膨脹趨勢而且體積較大，葉綠體內(nèi)充滿了氣泡，細胞內(nèi)可見葉綠體數(shù)量少，類囊體緊密度不及遮蔭處理的黃金菊和對照品種寧州2號的。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，遮蔭處理的第2葉、第4葉葉綠體數(shù)量、片層堆疊明顯多于自然光照條件，至第4葉時基本接近CK，甚至葉綠體的數(shù)量要多于對照品種寧州2號的。這也說明，黃金菊黃化可能主要與葉綠體數(shù)量、葉綠體的片層結構變化有關。

圖3 自然光照和遮蔭處理茶樹第2葉電鏡圖

圖4 自然光照和遮蔭處理茶樹第4葉電鏡圖

3 討論與結論

一般情況下，黃化或者白化茶樹品種的氨基酸含量高于普通綠茶，而酚類物質含量較低［13］，這也是使得黃化或者白化茶樹滋味更加鮮爽，口感為更多消費者所接受的原因之一。Wei等［14］通過采集不同地區(qū)的綠茶春季樣品來研究氣候條件和葉綠素相對含量對茶葉品質的影響，推測適度低溫、較低的葉綠素含量會形成較好的綠茶品質，說明培育低葉綠素品種可以作為改良茶葉品質的一條途徑，但葉綠素相對含量過低也會對茶樹生長造成影響，完全無法合成葉綠素的茶樹在苗期就可能死亡［15］。過去對白化茶樹品種白葉1號、白雞冠研究較多［16］，如中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶樹育種團隊研究了白葉1號茶樹白化—返綠過程中色素蛋白復合體的改變情況［17］，結果表明，白葉1號白化期間葉片中保留在捕光葉綠素蛋白復合體中的色素很少。顯微鏡掃描白葉1號成熟葉片發(fā)現(xiàn)，白化期內(nèi)膜系統(tǒng)逐漸解體［18］。白葉1號全白時期，所有葉肉細胞中葉綠體結構完全解體［19］。吳金全［20］研究了白雞冠白化前和返綠后的變化情況，結果表明其葉綠體結構和正常品種的差異不明顯；由于短期低溫環(huán)境（20 ℃左右）的影響，溫度敏感型茶樹葉綠體片層結構受到破壞，葉綠體正常代謝發(fā)育、生物合成受阻，進而產(chǎn)生白化植株。

在本試驗中，作者以寧州2號為對照，采用了透射電鏡技術比較了黃金菊遮蔭前后第2葉、第4葉色素含量、亞細胞結構、葉綠體變化的差異，結果發(fā)現(xiàn)：遮蔭后黃金菊色素含量增加迅速，葉綠體數(shù)量增加、葉綠體結構完整，沒有出現(xiàn)葉綠體解體及大量囊泡，但葉綠體中基粒片層堆疊明顯少于寧州2號。通過比較說明，黃金菊茶樹黃化與葉綠體中基粒片層合成減弱有關，但葉綠體損失不及白葉1號、白雞冠嚴重［19-20］。這解釋了黃金菊黃化而不白化，同時氨基酸含量不夠高、酚類物質不低的原因［13，16］。本研究發(fā)現(xiàn)黃金菊黃化可能與光脅迫情況下葉綠體數(shù)量的減少、葉綠體基粒片層堆疊不緊密或減少有關系。

本文以黃金菊為研究材料，選擇寧州2號為對照品種。通過比較黃金菊茶樹遮蔭前后表型性狀、色素含量、SPAD值以及葉綠體超微結構的變化，可以判斷黃金菊屬于光敏型黃化茶樹資源，正常生長的黃金菊茶樹由于受到光脅迫以致細胞中的葉綠體數(shù)量少、發(fā)育不完全，甚至葉綠體基粒片層堆疊不緊密等原因，是導致該茶樹黃化的直接原因。相關現(xiàn)象的產(chǎn)生對黃金菊物質代謝、品質性狀是否有調(diào)控作用，其機制是什么還需進一步分析。本研究為后續(xù)江西省深入研究黃色或白色茶樹產(chǎn)生，研究該變化的機理打下了堅實的基礎。