高效液相色譜法測定輻狀肋柱花中10種成分的含量

李維業(yè)，劉學(xué)良，劉安平，楊增亮，蘇媛，韓達(dá)斌，陳鵬，石春蘭，王開祥，問靜，鄒存生，郭宏英，劉海青*（.西寧市食品藥品檢驗檢測中心，西寧 80007；.青海省藥品審評核查中心，西寧80007；.三普藥業(yè)有限公司，西寧 8006）

輻狀肋柱花為龍膽科肋柱花屬輻狀肋柱花Lomatogonium rotatum（L.）Fries ex Nym.的干燥全草，生長于海拔3000 ～4100 m 的山坡、草地、灌叢中，在西藏、四川、青海、甘肅均有分布[1-3]，具有清肝利膽，清熱解毒和祛濕功效，可治急性黃膽型肝炎、急性腎盂腎炎、流行性感冒、膽病引起的發(fā)燒及瘡癤癰毒[4-8]?！恫厮幹尽分杏涊d：“機(jī)合滴”包括輻狀肋柱花、濕生扁蕾、橢圓葉花錨等多種藥材[9]，其化學(xué)成分常含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類、酮類等多種成分。其中環(huán)烯醚萜類具有抗氧化、保肝利膽、解痙、抗焦慮、抗腦缺血損傷等生物活性，黃酮類具有抗氧化、抗腫瘤等活性，酮類具有保肝利膽、強(qiáng)心利尿等生物活性[10-23]。

目前，輻狀肋柱花在藏藥制劑中使用廣泛，但現(xiàn)有的研究主要集中在對其成分和臨床藥理作用的研究，缺乏對其質(zhì)量檢測和標(biāo)準(zhǔn)的研究，其相關(guān)研究文獻(xiàn)較少，為了提高其臨床應(yīng)用價值，本研究采用高效液相色譜法對3 批輻狀肋柱花樣品中10 種成分的含量進(jìn)行測定，方法操作簡便、有效，可為今后進(jìn)一步研究輻狀肋柱花質(zhì)量提供試驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waterse2695 型高效液相色譜儀，Waters 2998 PDA 型二極管陣列檢測器，Waters 2695型Empower 化學(xué)工作站（美國Waters 公司）；XS105DU 梅特勒-托利多專業(yè)型XS 分析天平（精度：0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；SB25-12DT 新芝超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q2355 超純水機(jī)（美國密理博有限公司）。

1.2 試藥

對照品馬錢苷酸（純度：97.5%）、獐芽菜苦苷（純度：98.3%）、當(dāng)藥苷（純度：99.27%），蘆?。兌龋?1.7%）、木犀草素（純度：99.1%）、槲皮素（純度：99.8%）（中國食品藥品檢定研究院），對照品當(dāng)藥黃素（純度：99.37%）、當(dāng)藥醇苷（純度：100%）（成都普菲德生物技術(shù)有限公司），對照品苦龍膽脂苷（純度：98.0%，上海源葉生物科技有限公司），對照品8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮（中科院西北高原生物研究所孫洪發(fā)研究員提供）。甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水。3 批樣品信息詳見表1，經(jīng)青海省藥品審評核查中心劉海青主任藥師鑒定為龍膽科肋柱花屬植物輻狀肋柱花Lomatogonium rotatum（Diels et Gilg）Fern 的干燥全草。

表1 樣品信息表Tab 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

Waters SunFirODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈（A）-0.05%磷酸（B）溶液為流動相，梯度洗脫（0 ～6 min，5%～8%A；6 ～15 min，8%～10%A；15 ～20 min，10%～15%A；20 ～40 min，15% ～35%A；40 ～45 min，35%～60%A）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮與樣品中其他成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)不低于5000（見圖1）。

圖1 輻狀肋柱花HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of Lomatogonium rotatum

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品馬錢苷酸12.50 mg，獐芽菜苦苷21.88 mg，當(dāng)藥苷8.11 mg，蘆丁8.19 mg，當(dāng)藥黃素11.86 mg，木犀草素8.81 mg，苦龍膽脂苷9.11 mg，當(dāng)藥醇苷16.43 mg，槲皮素8.03 mg，8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮10.68 mg 分別置50、25、25、25、25、25、50、25、25、100 mL 量瓶中，加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液，再分別取各對照品儲備液2、6、2、2、1、2、1、2、1、1 mL 置25 mL 量瓶中，加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮質(zhì)量濃度分別為0.019 50、0.206 43、0.025 76、0.024 03、0.018 86、0.007 14、0.052 18、0.026 63、0.012 82、0.018 86 mg·mL－1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率250 W，頻率50 kHz），取出，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮對照品儲備液，以甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，進(jìn)樣測定，以峰面積（y）對數(shù)值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），用外標(biāo)兩點法計算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析，計算回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表2，10 種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 10 種成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Regression equation，linearity and correlation coefficients of 10 components

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮峰面積RSD分別為0.62%、0.20%、0.70%、0.43%、0.45%、0.51%、2.0%、1.8%、0.43%、1.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液（樣品編號：FZLZH-001），分別于0、2、4、8、16、24 h 按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，結(jié)果馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮峰面積RSD分別為0.62%、0.47%、0.56%、1.1%、0.39%、0.82%、0.71%、1.2%、0.93%、0.57%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取輻狀肋柱花樣品（樣品編號：FZLZH-001）6 份，按“2.3”項下方法制備，進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮的平均含量分別為0.139%、5.613%、0.450%、0.474%、0.193%、0.203%、0.011%、1.738%、0.032%、0.013%， 其RSD分別為1.4%、1.2%、0.83%、0.71%、0.97%、1.1%、0.85%、1.4%、1.8%、3.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

稱取輻狀肋柱花樣品（樣品編號：FZLZH-001）6 份，每份0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，在每組中分別加入“2.2”項下的混合對照品溶液5 mL，按“2.3”項下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率，結(jié)果得馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮的平均回收率分別為100.68%、96.55%、96.20%、98.88%、98.91%、96.20%、97.70%、98.10%、98.65%、99.45%，RSD分別為1.5%、2.7%、1.0%、1.4%、1.2%、1.2%、2.9%、1.5%、2.6%、1.8%。表明該方法的回收率良好。

2.9 樣品含量測定

3 批次輻狀肋柱花藥材粉末，按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并計算各批次輻狀肋柱花中10 種待測成分的含量。結(jié)果3 批次輻狀肋柱花藥材中馬錢苷酸含量在0.121%～0.153%、獐芽菜苦苷含量在4.876%～6.286%、當(dāng)藥苷含量在0.364%～0.466%、蘆丁含量在0.423%～0.509%、當(dāng)藥黃素含量在0.173%～0.203%、木犀草素含量在0.169%～ 0.217%、苦龍膽脂苷含量在0.009%～0.012%、當(dāng)藥醇苷含量在1.114%～1.738%、槲皮素含量在0.024%～0.032%，8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮含量在0.011%～0.015%（見表3）。

表3 樣品含量測定結(jié)果(%)Tab 3 Content determination of samples (%)

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

馬錢苷酸、獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、苦龍膽脂苷、當(dāng)藥醇苷、槲皮素、8-羥基-1，3，5-三甲氧基酮等具有保肝、抗氧化、消除水腫、抗炎及清除自由基、抗高血脂、改善糖尿病性腎病變狀況、抗微生物及腫瘤細(xì)胞等藥理作用[24]，且在檢測中有很好的分離度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等，故選擇這10 種成分作為輻狀肋柱花的檢測指標(biāo)來進(jìn)行研究，可以有效控制該藥材的內(nèi)在質(zhì)量。

3.2 檢測波長的確定

對10 種成分的甲醇溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果10 種成分在210 nm 和254 nm 測定都有較好的吸收，但在254 nm 可兼顧10 個成分的最大吸收，且色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形較好。故確定254 nm 作為本試驗的檢測波長。

3.3 溶劑系統(tǒng)

試驗中分別用甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-磷酸、甲醇-水-磷酸等流動相系統(tǒng)及流動相梯度經(jīng)多次試驗，結(jié)果以乙腈-0.05% 磷酸為流動相系統(tǒng)梯度洗脫對10 種成分的色譜峰分離度最好。

3.4 樣品制備

試驗中考察不同溶劑（水、乙醇、50%乙醇、甲醇、50%甲醇），不同溶劑用量（15、25、50 mL），不同提取方法（回流、超聲、冷浸），不同提取時間（15、30、45、60 min）等對樣品制備的影響，從混合對照品和樣品中被測成分的分離情況、基線的穩(wěn)定性及分析時間、含量、成本、時間等方面綜合分析，結(jié)果樣品提取以甲醇25 mL為溶劑、超聲30 min 處理效率最高，確定其為本研究的提取方法。

3.5 方法耐用性

試驗對方法耐用性進(jìn)行了考察，在標(biāo)準(zhǔn)條件的基礎(chǔ)上，對流速、柱溫、流動相比例及不同色譜柱進(jìn)行考察。不同柱溫、不同流速、不同色譜柱條件下測得的結(jié)果差異比較大，出現(xiàn)色譜峰的交換或重疊，最后確定流速為1.0 mL·min－1，柱溫為30℃，色譜柱型號為Waters SunFirODS C18柱，在此條件下對樣品含量測定結(jié)果重復(fù)性好。

3.6 其他成分測定

試驗過程中還嘗試開展了輻狀肋柱花中沒食子酸、山柰素、異葒草素、異牡荊素、齊墩果酸、熊果酸、1-羥基-3，4，5-三甲基酮等化學(xué)成分的含量測定試驗，但由于這些成分含量較低、分離不好等，本文未將其作為輻狀肋柱花的定量檢測指標(biāo)。

3.7 結(jié)果分析

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品之間被測成分含量差距較大，分析其原因，一方面可能受產(chǎn)地、采收期等的影響，樣品中各成分的含量有變化；另一方面，在干燥、儲藏及運輸過程中，花葉易脫落，從而造成含量變化較大，提示在藥材采集后的干燥、儲藏和運輸?shù)冗^程中，應(yīng)特別注意避免花葉脫落損失，以保證藥材質(zhì)量。本文采用HPLC 法同時測定輻狀肋柱花中10 種主要有效成分含量的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，該方法簡便、高效、準(zhǔn)確，為全面評估輻狀肋柱花這種藥用植物的質(zhì)量和新藥研究開發(fā)可提供一定的參考。