基于高效液相色譜法對淡豆豉發(fā)酵過程中6種異黃酮含量的動態(tài)分析

曹冬英，謝思靜，曾思婷，隋利強，徐偉（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建省中藥炮制技術傳承基地，福州350122）

淡豆豉，又名“香豉”“豆豉”“豉”，為豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟種子（黑豆）的發(fā)酵加工品[1]。其味苦、辛，性涼，歸肺、胃經(jīng)，有解表、除煩、宣發(fā)郁熱的作用，在臨床上主要用于感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等癥[2]。

淡豆豉歷代炮制方法有燒制、熬制、炒制、清酒制、醋蒸制、炒焦法、鹽醋拌蒸法以及清蒸法等[3-6]。2020年版的《中國藥典》收載的淡豆豉發(fā)酵方法為青蒿、桑葉加水煎煮，煎液拌入大豆，大豆吸汁后蒸透，晾涼，再用青蒿、桑葉渣悶制使發(fā)酵至黃衣上遍，除去藥渣之后再進行悶制直到香氣溢出，再略蒸，干燥即得淡豆豉成品[1]。

淡豆豉在不同地區(qū)炮制方法略有差異，《全國中藥炮制經(jīng)驗與規(guī)范集成》（2017年版增修本）[7]中一共收載了42 種關于淡豆豉的炮制方法，其中24 種方法是直接發(fā)酵不經(jīng)過悶制，18 種方法經(jīng)過發(fā)酵后再悶制。《全國中藥飲片炮制規(guī)范輯要》（2016年版）[8]中則收載了20 種淡豆豉的炮制方法，其中，直接發(fā)酵和經(jīng)過發(fā)酵后再悶制的方法各10 種。關于淡豆豉發(fā)酵過程中再悶制工藝合理性與否也存在爭議。

淡豆豉中含有黃酮類、多糖類、豆豉纖溶酶、大豆皂苷、蛋白質(zhì)等成分，其中異黃酮具有預防更年期、乳腺癌以及改善骨質(zhì)疏松，預防心血管疾病、阿爾茨海默病等藥理活性[9]，并且在淡豆豉中主要以游離型的苷元和結合型的糖苷存在，故本文主要通過收集淡豆豉不同發(fā)酵階段的樣品，通過HPLC 法測定6 種異黃酮的含量，分析不同發(fā)酵階段6 種異黃酮含量動態(tài)變化，探討發(fā)酵過程中再悶制環(huán)節(jié)的必要性，為淡豆豉的工藝和原理研究提供理論參考。

1 材料

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SQP 型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；大豆苷（批號：P14M10F83057）、大豆苷元（批號：C06N6Y5504）、黃豆黃苷（批號：P06J9F65073）、黃豆黃素（批號：G16J9C65571）、染料木苷（批號：P09M8F31018）、染料木素（批號：H30A9Z69019）（上海源葉生物科技有限公司，以上對照品純度均大于98%）；甲醇為色譜純（德國Merck 公司）；甲酸為色譜純（上海阿拉丁試劑有限公司）。

黑豆（市售），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為豆科植物黑大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟種子。桑葉（北京本草方源藥業(yè)集團有限公司，批號：20170508）經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為?？浦参锷orus alba（L.）的葉。青蒿（安徽順和堂中藥飲片有限公司，批號：171201）經(jīng)福建中醫(yī)藥大學車蘇容副教授鑒定為菊科植物黃花蒿Artemisia annua（L.）的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 淡豆豉樣品的制備[1]

黑大豆洗凈，取青蒿、桑葉加水煎煮，紗布過濾，濾渣備用，煎液濃縮，冷卻拌入凈大豆，藥汁吸盡后蒸透，取出，晾涼。置容器內(nèi)，紗布覆蓋，濾過的青蒿、桑葉渣均勻覆蓋于紗布上，置于室溫，悶制發(fā)酵，于發(fā)酵第2日、第4日、第6日、第13日分別取出部分黑豆留作淡豆豉樣品，并標記為Y-2、Y-4、Y-6、Y-13。

取發(fā)酵后的淡豆豉清洗稍晾，置于密閉容器內(nèi)水浴50 ～60℃，保溫，進行第二次悶制發(fā)酵，分別在第二次發(fā)酵的第3日、第9日和第15日分別取出部分黑豆留作淡豆豉樣品，并標記為Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15。

取Y-2、Y-4、Y-6、Y-13、Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15 共7 份樣品，干燥，粉碎，過二號篩。

2.2 色譜條件[10-11]

采用Welch Ultimate XB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-甲酸0.1%（B）為流動相，梯度洗脫（0 ～7 min，25%～30%A；7 ～12 min，30% ～45%A；12 ～20 min，45%A；20 ～27 min，45% ～60%A；27 ～33 min，60% ～75%A；33 ～35 min，75%～25%A；35 ～40 min，25%A），流速為0.8 mL·min－1，柱溫為30℃，檢測波長為254 nm。理論塔板數(shù)均不低于5000。樣品和對照品HPLC色譜圖見圖1。

圖1 對照品及淡豆豉樣品HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance and Sojae Seman Praeparatum sample

2.3 混合對照品溶液的制備

取對照品大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素適量，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加入70%甲醇超聲溶解，制成質(zhì)量濃度分別為730、1200、916、608、892 和564 μg·mL－1的單一對照品儲備液，備用。分別精密量取上述對照品儲備液各1 mL，置同一10 mL 量瓶中，加70%甲醇至刻度混勻，得到質(zhì)量濃度為大豆苷73 μg·mL－1、大豆苷元120 μg·mL－1、黃豆黃苷91.6 μg·mL－1、黃豆黃素60.8 μg·mL－1、染料木苷89.2 μg·mL－1、染料木素56.4 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

依次取樣品粉末（過二號篩）約1 g，精密稱定，分別置于50 mL 錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用70%色譜甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液至進樣瓶中備用。

2.5 標準曲線的制備

精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素各對照品，加入70%甲醇超聲溶解，定容至5 mL 量瓶，再用70%甲醇稀釋為不同梯度質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按“2.2”項下的色譜條件測定。以大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，見表1。

表1 淡豆豉中6 種異黃酮的線性范圍考察結果Tab 1 Linear range of 6 isoflavones in Sojae Seman Praeparatum

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.3”項下的混合對照品溶液10 μL，按照“2.2”項下的色譜條件連續(xù)進樣6 次測定，測得大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、黃豆黃苷、染料木素、染料木苷的峰面積RSD分別為0.078%、0.062%、0.042%、0.23%、0.039%、2.5%。說明精密度良好。

2.7 重復性試驗

稱取淡豆豉粉末，按“2.4”項下的方法制備成供試品溶液，按照“2.2”項下的色譜條件進樣6 次，計算得大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素峰面積的RSD分別為3.0%、0.47%、2.6%、1.2%、2.8%、2.4%，結果表明方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密稱取編號為Y悶-15 的淡豆豉粉末，按“2.4”項下的方法制備成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按照“2.2”項下的色譜條件進樣測定，計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素峰面積的RSD值分別為2.8%、1.9%、1.2%、0.71%、1.4%、1.2%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗

取編號為Y悶-15 的淡豆豉粉末，精密稱定約1 g，每份加入等量的6 份混合對照品溶液，按照“2.4”項下的方法制備供試品溶液，再按照“2.2”項下的色譜條件進樣測定，計算大豆苷、大豆苷元、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、染料木素的平均加樣回收率為103.66%、99.51%、101.40%、99.44%、103.89%、101.76%；RSD分別為3.7%、2.5%、3.7%、3.6%、3.3%、3.3%。

2.10 樣品的含量測定

取編號為Y-2、Y-4、Y-6、Y-13、Y悶-3、Y悶-9、Y悶-15 的淡豆豉粉末樣品，精密稱取1 g，分別置于50 mL 錐形瓶中，再分別精密加入70%色譜甲醇25 mL，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用70%色譜甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液至進樣瓶中，按照“2.2”項下的方法進樣測定，代入回歸方程計算出每份樣品中6 種異黃酮的濃度以及6 種異黃酮的含量，結果見表2，用折線統(tǒng)計圖表示6 種異黃酮含量動態(tài)變化，見圖2。

表2 淡豆豉不同發(fā)酵階段6 種異黃酮的含量(n ＝3)Tab 2 Content of 6 isoflavones in different fermentation stages of Sojae Seman Praeparatum (n ＝3)

圖2 淡豆豉不同發(fā)酵階段6 種異黃酮含量動態(tài)變化趨勢圖Fig 2 Dynamic change of 6 isoflavones in different fermentation stages of Sojae Seman Praeparatum

3 討論

3.1 悶制過程中主要成分含量變化

由圖2 可直觀看出，淡豆豉發(fā)酵過程中，大豆苷元、染料木素和黃豆黃素3 種苷元含量總體呈上升趨勢，以大豆苷元的變化趨勢最顯著；染料木苷、大豆苷和黃豆黃苷3 種苷含量總體呈下降趨勢，以染料木苷的下降趨勢最顯著。

大豆苷元從發(fā)酵開始，含量變化上升顯著，第二次悶制的第3日含量上升最顯著；染料木素在第一次悶制發(fā)酵階段前6 d 含量變化不大，第13日含量有明顯上升趨勢；黃豆黃素在第一次悶制發(fā)酵的前4 d 含量增加最為顯著，此3 種苷元都是第二次悶制發(fā)酵階段第9日含量達到峰值，到第二次悶制發(fā)酵階段第15日含量有所下降，提示第二次悶制發(fā)酵階段對于苷元含量的積累有顯著影響，可嘗試縮短悶制時間。染料木苷從發(fā)酵開始，含量持續(xù)下降，并且下降幅度最大；大豆苷在發(fā)酵第4日含量下降幅度最大，此后含量呈較緩下降趨勢；黃豆黃苷在發(fā)酵前6 d 含量下降不大，第13日有明顯下降趨勢。此3 種苷類成分的含量都是第二次悶制發(fā)酵階段第9日達到最低值，但在第15日都有所上升。結果提示，在淡豆豉發(fā)酵過程中存在苷到苷元的轉(zhuǎn)化并且第二次悶制發(fā)酵的過程中苷和苷元會持續(xù)轉(zhuǎn)化。

大豆苷具有良好的降血壓和改善腦循環(huán)的作用；大豆苷元具有類雌激素樣作用[12]，對于治療婦女更年期綜合征等具有良好效果；黃豆黃苷具有抗病毒、抗菌的作用[13]，可以防止骨質(zhì)疏松和心腦血管疾??；黃豆黃素除了能夠降低胃癌細胞的存活率[14]，還可以誘發(fā)細胞程序性死亡；染料木苷具有抗增殖、抗腫瘤血管生成，以及誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡等作用[15]；染料木素具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡等活性[16]。再悶制階段有利于苷向苷元轉(zhuǎn)化，該過程主要由于葡萄糖苷酶作用于糖苷型異黃酮的氧苷鍵，使其葡萄糖基團脫掉，供微生物代謝，使糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元。因大豆苷元、染料木素等異黃酮苷元較糖苷型異黃酮具有更高的生物活性[17]，所以淡豆豉發(fā)酵后解表、除煩功效增強。

3.2 提取溶劑的優(yōu)化

在前期試驗的基礎上，結合參考文獻，對淡豆豉中6 種異黃酮的提取溶劑進行了優(yōu)化，比較了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇的提取效果。結果顯示，70%甲醇提取效果較好，且雜質(zhì)相對較少，故本試驗采用70%甲醇作為提取溶劑。

3.3 小結

淡豆豉在不同地區(qū)炮制方法略有差異，對于發(fā)酵過程的悶制環(huán)節(jié)是否必要，不同學者也持有不同見解，本試驗收集淡豆豉不同發(fā)酵階段的樣品，分析6 種異黃酮含量動態(tài)變化，結果顯示，淡豆豉發(fā)酵過程中存在苷到苷元的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，再悶制環(huán)節(jié)有利于苷轉(zhuǎn)化成苷元，并且大豆苷元、染料木素等異黃酮苷元較糖苷型異黃酮具有更高的生物活性。該結果提示，淡豆豉發(fā)酵過程再悶制是必要過程，是有利于藥效成分轉(zhuǎn)化的發(fā)酵階段。后期試驗可結合不同階段解表、除煩作用的研究，對再悶制過程的必要性進一步分析探討，結合淡豆豉發(fā)酵過程中藥理作用的變化，為淡豆豉炮制工藝和炮制原理研究提供參考。