MAP4K1影響T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功能研究進(jìn)展

劉秀盈，劉靜靜，朱晶晶，馮義超，王建勛（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488）

腫瘤微環(huán)境（tumor micro-environment，TME）是指腫瘤細(xì)胞周圍存在的微環(huán)境，包括位于腫瘤病灶中心、邊緣或附近的非惡性細(xì)胞、血管、淋巴器官或淋巴結(jié)、神經(jīng)、細(xì)胞間成分和代謝物。缺氧和免疫抑制是TME 的標(biāo)志，這一特殊的環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞在生物體內(nèi)的生存和遷移，而對(duì)免疫細(xì)胞起著抑制作用，其中包括細(xì)胞免疫的主體——T 細(xì)胞[1]。絲裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAP4K1）是一種免疫抑制調(diào)節(jié)激酶，在造血細(xì)胞中有限制性表達(dá)，是MAPK 信號(hào)通路的重要組成部分[2]，本文就MAP4K1 影響T 細(xì)胞在TME 中的功能的研究進(jìn)展作一綜述。

MAP4K1，亦稱造血祖細(xì)胞激酶1（hematopoietic progenitor kinase 1，HPK1），是一種造血細(xì)胞特異性表達(dá)的絲氨酸-蘇氨酸激酶，是哺乳動(dòng)物Ste20 相關(guān)蛋白激酶MAP4K 的家族成員，家族中包括MAP4K1、MAP4K2、MAP4K3、MAP4K5、MAP4K6 等，它們具有高度相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在JNK-p38 MAPK 通路擔(dān)任重要角色。MAP4K1由一個(gè)N 末端的激酶結(jié)構(gòu)域、SH3 結(jié)合的富含脯氨酸的中間基序和C 末端的一個(gè)檸檬酸同源結(jié)構(gòu)域組成，這表明激酶和支架功能在MAP4K1 的各種活動(dòng)中都可能是重要的[2-3]。

1 MAP4K1 是T 細(xì)胞表面特異的抗原受體（TCR）信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子

MAP4K1 是TCR 信號(hào)下游SH2 攜帶蛋白的一個(gè)激酶[4]。MAP4K1 缺失的T 細(xì)胞不能磷酸化SLP76 蛋白的第376 號(hào)位點(diǎn)的絲氨酸，這導(dǎo)致激活蛋白1（AP-1）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑表達(dá)下調(diào)[5-8]。細(xì)胞生物學(xué)研究表明，細(xì)胞質(zhì)中的MAP4K1 在TCR 激活時(shí)被招募到質(zhì)膜上，而活性MAP4K1 則使接頭蛋白SLP76 磷酸化，從而激活SLP76 作為負(fù)調(diào)節(jié)蛋白14-3-3p 的對(duì)接位點(diǎn)，進(jìn)而引起蛋白酶體介導(dǎo)的SLP76 的降解，最終破壞TCR 信號(hào)復(fù)合體的穩(wěn)定[2]。MAP4K1缺失的T 細(xì)胞在TCR 信號(hào)通路中，ERK MAPK活性、AP-1 和活化T 細(xì)胞核因子（NFAT）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄水平升高，從而導(dǎo)致白介素2（IL-2）分泌水平升高[2，9]。

2 MAP4K1 的缺失促進(jìn)T 細(xì)胞向腫瘤遷徙

被抗原激活的T 細(xì)胞需要趨化信號(hào)來引導(dǎo)其向腫瘤遷移。在荷瘤K46M 小鼠（MAP4K1點(diǎn)突變體）的腫瘤引流淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)趨化因子CX3CL1 的轉(zhuǎn)錄水平升高，并且在K46M 小鼠體內(nèi)的腫瘤中觀察到CD4＋和CD8＋腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）增加以及在K46E（MAP4K1點(diǎn)突變體）小鼠體內(nèi)的腫瘤中CD8＋TIL 增加，由此推論MAP4K1 激酶活性的喪失可能是趨化因子介導(dǎo)的腫瘤趨化作用增強(qiáng)的原因[6]?？乖T導(dǎo)的CD8＋細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞朝著不斷增加的趨化因子梯度遷移，這一過程需要將β2 整合素，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1（LFA-1）與其同源配體表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）結(jié)合[10]，LFA-1 與ICAM-1 的親和力由TCR 和趨化因子受體提供的信號(hào)調(diào)節(jié)[11]。MAP4K1 通過與SLP76的SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其無法與脫顆粒適配蛋白（ADAP）形成超分子復(fù)合物[12]。在這個(gè)模型中，沒有證據(jù)表明MAP4K1 是通過其激酶活性介導(dǎo)負(fù)調(diào)控功能的，而是通過其蛋白支架能力與基于ADAP 的LFA-1 激活復(fù)合物競爭并破壞其最終產(chǎn)物的形成來實(shí)現(xiàn)的[13]。

3 MAP4K1 的缺失減緩T 細(xì)胞耗竭

抗原的持續(xù)刺激、TME 中抑制性免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的存在、抑制性受體表達(dá)上調(diào)、T 細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化以及代謝因素均可導(dǎo)致T 細(xì)胞耗竭。如何防止T 細(xì)胞耗竭，從而延長其效應(yīng)功能，是目前免疫腫瘤學(xué)的重要研究內(nèi)容。已有證據(jù)充分證明，胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率盒蛋白（TOX）和核受體4A1（NR4A1）是T 細(xì)胞耗竭的驅(qū)動(dòng)因素，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與野生型T 細(xì)胞相比，MAP4K1敲除的T 細(xì)胞中TOX 和NR4A1的表達(dá)水平顯著降低，且CD8＋T 細(xì)胞耗竭由MAP4K1-NFκB-Blimp1 信號(hào)級(jí)聯(lián)驅(qū)動(dòng)[14]。故而MAP4K1 的缺失能夠有效減緩T 細(xì)胞耗竭。

4 MAP4K1 對(duì)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）的影響

在腫瘤免疫的背景下，Tregs 抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，MAP4K1敲除的Tregs 缺乏有效抑制TCR 誘導(dǎo)的效應(yīng)性T 細(xì)胞增殖反應(yīng)的能力。與野生型Tregs 相比，MAP4K1敲除的Tregs 通過持續(xù)升高的ERK MAPK 和RelA 核因子κB（NFκB）磷酸化來響應(yīng)TCR 信號(hào)。多重細(xì)胞因子分析顯示，在抗CD3ε和抗CD28 嵌合抗原受體T 細(xì)胞（CAR-T）的共刺激域交聯(lián)的刺激下，MAP4K1敲除的Tregs 表現(xiàn)出異常的細(xì)胞因子表達(dá)，包括IL-2、IFN-γ和趨化因子如巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-α和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-β的表達(dá)增加[15]。經(jīng)過對(duì)Tregs 的穩(wěn)態(tài)水平進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)與野生型Tregs 相比，MAP4K1敲除的Tregs的穩(wěn)態(tài)水平更高[2，15]。

5 MAP4K1 的缺失增強(qiáng)T 細(xì)胞殺傷腫瘤的能力

MAP4K1敲除的CD4＋T 細(xì)胞可通過細(xì)胞間直接的相互作用或IL-2 的介導(dǎo)改善CD8＋T 細(xì)胞活化的啟動(dòng)，促進(jìn)CD8＋效應(yīng)細(xì)胞向記憶細(xì)胞的分化。CD4＋T 細(xì)胞還協(xié)調(diào)樹突狀細(xì)胞激活CD8＋T 細(xì)胞，將腫瘤抗原交叉提呈給CD8＋T 細(xì)胞，或者通過誘導(dǎo)IL-2 的產(chǎn)生來激活CD8＋T 細(xì)胞。值得注意的是，有研究發(fā)現(xiàn)MAP4K1 缺失使小鼠腫瘤引流區(qū)淋巴結(jié)中CD4＋Ki67＋（增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原）和CD8＋Ki67＋T 細(xì)胞顯著增加，這進(jìn)一步證明了荷瘤小鼠MAP4K1 激酶失活后CD4＋和CD8＋T 細(xì)胞之間的正相互作用[6]。

MAP4K1敲除使 CD8＋T 細(xì)胞的擴(kuò)增和效應(yīng)功能更強(qiáng)大，這證明了MAP4K1 的缺失在產(chǎn)生和維持有效的細(xì)胞毒性和記憶性CD8＋T 細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的結(jié)論。MAP4K1敲除的 CD8＋T 細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞刺激后表現(xiàn)出更高的激活狀態(tài)和更高的CD69表達(dá)水平，并在體外刺激時(shí)顯著增加IFN-γ和TNF-α的釋放水平[16]。此外，MAP4K1敲除的脾淋巴細(xì)胞在體外被相同腫瘤細(xì)胞再次攻擊時(shí)表現(xiàn)出明顯更好的回憶反應(yīng)及更強(qiáng)的腫瘤殺傷能力[6]。

在Lewis 肺癌模型中，輸注MAP4K1敲除的T 細(xì)胞可以賦予宿主小鼠抵抗肺癌的能力，揭示了MAP4K1 在T 細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的固有反應(yīng)中的重要性[17]。如K46E 和K46M 小鼠中GL261膠質(zhì)瘤和1956 肉瘤的生長均得到了控制[5-6]。其中，K46E 小鼠體內(nèi)的GL261 腫瘤中檢測(cè)到更多的CD8＋T 細(xì)胞的浸潤，IFN-γ和TNF-α表達(dá)水平升高。同樣，K46M 小鼠中1956 腫瘤的生長速度被有效緩解，對(duì)此模型中TIL 的分析結(jié)果顯示，Treg 浸潤顯著減少，因此CD8＋Treg 細(xì)胞比率相應(yīng)增加。定量PCR 和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，參與介導(dǎo)抗腫瘤免疫的免疫細(xì)胞標(biāo)志物在K46M 小鼠中升高，其中最顯著的是CD4、CD8、IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B、CD28（T 細(xì)胞共刺激分子）、CD11c 和CD11b（黏附蛋白白細(xì)胞整合素家族成員，可用于標(biāo)記白細(xì)胞）。在腫瘤抗原背景下抑制MAP4K1 的功能使CD8＋T 細(xì)胞的數(shù)量和活性都得到改善，甚至能夠誘導(dǎo)高親和力CD8＋T 細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)腫瘤進(jìn)行更有效的殺傷[18]。

6 靶向MAP4K1 的藥物

目前并沒有靶向MAP4K1 的藥物上市，6 項(xiàng)與之相關(guān)的臨床試驗(yàn)，均為Ⅰ期試驗(yàn)，其中5 項(xiàng)標(biāo)注為MAP4K1 的拮抗劑，1 項(xiàng)是通過基因編輯技術(shù)與CAR-T 聯(lián)用，詳見表1。

表1 與MAP4K1 相關(guān)的臨床試驗(yàn)Tab 1 Clinical trials related to MAP4K1

6.1 小分子拮抗藥物

基因證據(jù)表明，MAP4K1 有可能成為免疫腫瘤學(xué)新的藥物靶點(diǎn)，這刺激了大量制藥公司以及學(xué)術(shù)研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行以開發(fā)MAP4K1 小分子激酶抑制劑為重點(diǎn)的臨床前研究，結(jié)果表明在缺氧和富含腺苷的腫瘤微環(huán)境中，單獨(dú)抑制MAP4K1 或聯(lián)合抗程序性死亡受體1（PD-1）/程序性死亡受體 - 配體1（PD-L1）的免疫治療可能導(dǎo)致免疫耐受[19-20]。在拮抗劑的研發(fā)過程中，鑒于有相當(dāng)多的Ste20 家族成員具有MAP4K 的功能，并且它們的激酶結(jié)構(gòu)域與MAP4K1 有很高的序列同源性，因此想要開發(fā)一種高度選擇性的小分子而不抑制MAP4K1 的一個(gè)或多個(gè)密切相關(guān)的Ste20 家族成員是極具挑戰(zhàn)性的[5，21-22]。拮抗劑在應(yīng)用過程中的一大難點(diǎn)即全身用藥的毒副作用，因此靶向給藥系統(tǒng)仍需不斷完善，以滿足臨床需求[23]。

6.2 基因編輯

通過輸注MAP4K1敲除的T 細(xì)胞以獲得強(qiáng)大的T 細(xì)胞功能，目前僅在小鼠身上得到成功[16]。CAR-T 療法是目前炙手可熱的免疫療法，有研究表明針對(duì)人類表皮生長因子受體2（HER2）、白細(xì)胞抗原分化簇19（CD19）和B 細(xì)胞成熟蛋白（BCMA）這3 個(gè)靶點(diǎn)聯(lián)合MAP4K1敲除的CAR-T 細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤功能均較聯(lián)合PD-1 敲除的CAR-T 細(xì)胞顯著增強(qiáng)[14]。MAP4K1 激酶缺失增強(qiáng)T 細(xì)胞功能的作用是T 細(xì)胞自主的，而不是反映MAP4K1敲除樹突狀細(xì)胞對(duì)T 細(xì)胞功能的影響[4]，故在T 細(xì)胞上單一的敲除MAP4K1應(yīng)當(dāng)能夠得到明顯的效果。將MAP4K1缺失的影響局限于受過基因編輯的T 細(xì)胞，自身安全性較全身性用藥有大大的提升，但是也增加了成本和制備時(shí)間。

6.3 蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs）

降解靶蛋白是近些年抗腫瘤藥物研發(fā)的新策略，與傳統(tǒng)的直接功能抑制相比，在效率、作用持續(xù)時(shí)間和對(duì)抗補(bǔ)償信號(hào)方面，靶蛋白的細(xì)胞降解提供了實(shí)質(zhì)性的治療優(yōu)勢(shì)。采用此類小分子藥物預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)MAP4K1 抑制和降解顯著促進(jìn)了CD4＋和CD8＋T 細(xì)胞的增殖以及IFN-γ的分泌，增強(qiáng)了抗腫瘤的效果[14]。與拮抗劑相似，如何克服其全身用藥的毒副作用也是非常重要的。

7 展望

T 細(xì)胞是免疫應(yīng)答的主體細(xì)胞，但免疫細(xì)胞活化后會(huì)釋放非冗余的負(fù)調(diào)節(jié)因子（稱為免疫檢查點(diǎn)），這減弱了T 效應(yīng)細(xì)胞的活性，使過度刺激對(duì)宿主造成損害的可能性降到最低。雖然最著名的檢查點(diǎn)是表達(dá)在T 細(xì)胞表面的負(fù)協(xié)同受體，如細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）和PD-1，但細(xì)胞內(nèi)檢查點(diǎn)也是存在的，其中MAP4K1 備受關(guān)注，因?yàn)樗cTCR 信號(hào)有密切關(guān)系。本文總結(jié)得出MAP4K1的敲低能夠減輕T細(xì)胞耗竭，增強(qiáng)T 細(xì)胞功能及細(xì)胞因子的釋放水平，提升T 細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)水平。MAP4K1缺失的T細(xì)胞表現(xiàn)出較低的TCR 激活閾值，伴隨的高反應(yīng)性表型，因此與PD-1 相似，MAP4K1 可能會(huì)是下一個(gè)腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)研究對(duì)象。

如何抑制MAP4K1 功能的方法并不成熟，由于家族成員結(jié)構(gòu)相似，拮抗劑的研發(fā)也并不完全安全，已經(jīng)有幾個(gè)化合物被證實(shí)與家族多個(gè)成員均可產(chǎn)生反應(yīng)，蛋白降解靶向嵌合體（PROTACs）的研發(fā)也是困難重重，基因編輯技術(shù)雖然熱門但是距離能夠在臨床上應(yīng)用也還有一段路要走。故而尋找更加安全和高效的靶向MAP4K1 的抑制劑，研究如何安全、便捷地進(jìn)行基因敲除的研究非常重要。

綜上所述，本文總結(jié)了MAP4K1 在TME 中對(duì)T 細(xì)胞功能影響的最新進(jìn)展，這對(duì)研究與MAP4K1相關(guān)的腫瘤免疫治療有重要意義，為開發(fā)以MAP4K1 為靶點(diǎn)的藥物以及抗腫瘤治療提供了新的思路與方案。