楊建婷,梁引庫,王全華*(.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院藥劑科,西安 70065;.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西 漢中 73000)
臨床上真菌感染性疾病不斷增多,白念珠菌(又稱白假絲酵母菌)是最常見的一種條件致病性真菌病原體,定植于人體的各個部位,其生長主要受宿主免疫力、壓力、微生物菌落和其他因素的影響[1]。隨著真菌耐藥性不斷升高且日益嚴(yán)重,開發(fā)新型抗白念珠菌的植物藥成為近些年來的研究熱點[2]。我國科學(xué)家經(jīng)過幾十年的探索,發(fā)現(xiàn)許多中草藥具有抗真菌作用,對白念珠菌有抑制作用的中藥有決明子、苦參、黃芩、烏梅等[3]。中草藥活性成分抗白念珠菌的作用機制是通過破壞菌體的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)和結(jié)構(gòu)而達到抗真菌作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn),蒲公英提取物對金黃色葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌等均有不同程度的抑制作用[5]。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn),通過水提、醇提、超聲提取法等分別提取出蒲公英多糖、黃酮和酚酸等,利用平板打孔法研究各活性成分對沙門菌、痢疾桿菌、大腸埃希菌、葡萄球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果,結(jié)果顯示不同提取方法對四種菌的抑制作用不同[6]。本文在蒲公英提取物對細(xì)菌抑菌作用的研究基礎(chǔ)上,研究其對真菌的抑制作用,以白念珠菌為研究對象,從最低抑菌濃度(MIC)、掃描電鏡(SEM)、抑菌動力學(xué)、細(xì)胞膜通透性和對細(xì)胞壁葡聚糖合成的影響五個方面,研究蒲公英提取物對白念珠菌的抑制作用及機制,旨在從植物中尋找抗真菌藥物,為開發(fā)廣譜、高效、低毒的抗真菌藥物提供參考。
白念珠菌(Candida albicans,C.albicans,批號:ATCC10231,該菌株凍干菌種由陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點實驗室菌種保藏中心提供),-80℃低溫冰箱凍存,實驗前復(fù)蘇傳代使用。
氫氧化鈉、濃鹽酸(37%)、無水乙醇、戊二醛、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鉀(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);吐溫80(Tween 80)、二甲基亞砜(DMSO)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);氯霉素(上海瑞楚生物科技有限公司);葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);溴化鉀(PIKE,光譜純,北京英萊克科技發(fā)展有限公司);蒲公英全草(漢中市中藥材市場,經(jīng)陜西理工大學(xué)吳三橋教授鑒定為菊科植物蒲公英)。
紫外分光光度計UV250(日本島津);電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS(上海申安醫(yī)療器械廠);臺式高速離心機TGL-20(湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司);超低溫冰箱-80℃DW-86L338J(青島海爾特種電冰柜有限公司);超凈工作臺SW-CJ-1F(蘇州凈化有限公司);低溫冷凍干燥機SJIA-10N(寧波市雙嘉儀器有限公司);掃描電子顯微鏡JSM-6390LV(日本電子公司);紅外光譜儀FT-IR(美國Nicolette 公司);真空干燥箱XMTD-8222(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。
蒲公英有效成分根據(jù)圖1 工藝路線進行提取。提取樣品Ⅰ經(jīng)干燥后密封凍存。
圖1 蒲公英活性成分的分離純化工藝路線Fig 1 Extraction and purification of active ingredients in dandelion
色譜柱:DiKMA Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。乙腈為流動相A,0.1%甲酸水溶液為流動相B,使用梯度洗脫(0 ~10 min 92% B;10 ~24 min,92% →86%B;24 ~35 min,86%→77%B;35 ~56 min,77%→76%B;56 ~60 min,76%→68%B)[7]。
將活化后的白念珠菌單菌落接種于沙式液體培養(yǎng)基,37℃、200 r·min-1培養(yǎng)12 h,用沙式液體培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)至1×107CFU·mL-1,配制280 mg·mL-1蒲公英樣品Ⅰ母液,備用。分別向裝有2 mL 沙式培養(yǎng)基的試管中加入蒲公英樣品Ⅰ,使培養(yǎng)基中蒲公英樣品Ⅰ最終質(zhì)量濃度為0、4.0、8.0、16.0、32.0、48.0、64.0 mg·mL-1,以0 mg·mL-1作為對照,按5%(V/V)接入備用菌液,分別于37℃、200 r·min-1培養(yǎng)24 h,用分光光度計測A600nm值。與前一濃度相比較,當(dāng)A600nm下降≥95%時的樣品的濃度即為蒲公英樣品Ⅰ的MIC[8]。每組設(shè)置3 個平行。
用1×107CFU·mL-1菌液配制280 mg·mL-1蒲公英樣品Ⅰ母液,備用。取2 mL 懸浮菌體,分別加入蒲公英樣品Ⅰ母液,使溶液中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、0.5、1、2×MIC,以0×MIC作為對照,分別于37℃、200 r·min-1培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至5 h 時,取1 mL 的菌體樣品,4℃、8000 r·min-1離心6 min,PBS(pH 5.8)洗滌2 次。加入2.5%戊二醛過夜固定,使用呈梯度濃度的乙醇溶液(50%、60%、70%、80%、90%)重懸浸泡10 min,于4℃、8000 r·min-1離心6 min;乙醇重懸浸泡10 min,4℃、8000 r·min-1離心6 min,2 次,脫水,用真空冷凍干燥機干燥12 h。鍍金后上SEM 觀察[9]。每組設(shè)置3 個平行。
用1×107CFU·mL-1菌液配制280 mg·mL-1蒲公英樣品Ⅰ母液,備用。分別向裝有4 mL 沙式液體培養(yǎng)基的試管中加入蒲公英樣品Ⅰ,使培養(yǎng)基中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、1、3×MIC,以0×MIC作為空白對照,按5%(V/V)接入備用菌液,分別于37℃、200 r·min-1培養(yǎng),每隔3 h 取樣200 μL,測其A600nm值。每組設(shè)置3 個平行。按式1 計算白念珠菌存活率和抑菌率[10-11]。
式1:存活率(%)=A600nm(加入抗菌樣的吸光度)/A600nm(未加入抗菌樣的吸光度)×100%。
按照“2.3”項下方法培養(yǎng)白念珠菌,將菌液于6000 r·min-1離心10 min,收集菌體,pH 5.8 PBS 洗3 次。用含0.01% Tween 80 的pH 5.8 PBS懸浮菌體,調(diào)整為1×109CFU·mL-1。分別向裝有2.5 mL 懸浮菌體的10 mL 試管中加入蒲公英樣品Ⅰ,使溶液中蒲公英樣品Ⅰ最終濃度為0、0.5、1、2×MIC,以0×MIC作為空白對照,37℃、200 r·min-1培養(yǎng),分別于0、1、2、4、6 h 取樣200 μL,6000 r·min-1離心10 min 后測上清液A260nm值[12]。每組設(shè)置3 個平行。
數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0、Origin 8.0 軟件,物質(zhì)結(jié)構(gòu)式繪制使用ChemDraw 軟件,圖片處理使用Photoshops 5.0。數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)評估,使用單因素方差分析(ANOVA)來比較差異組,P<0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
HPLC 分析蒲公英樣品Ⅰ組分(見圖2),發(fā)現(xiàn)該組分在280 nm 處主要有8 種化合物,其保留時間依次為21.5、27.9、30.3、37.2、38.9、39.8、44.7 和66.2 min,相對百分含量分別為11.45%、3.96%、10.48%、34.24%、3.91%、11.80%、3.65%和4.21%。經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)峰1、峰2、峰3、峰4、峰5 和峰6 依次被初步確定為4-香豆酸、阿魏酸、槲皮素戊糖苷、3,5-二-O-咖啡??崴帷?,5-二-O-咖啡酰奎寧酸和木犀草素,而峰7 和峰8為未知化合物。
圖2 蒲公英樣品Ⅰ的HPLC 色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of dandelion sampleⅠ
結(jié)果表明隨著蒲公英樣品Ⅰ質(zhì)量濃度增加,白念珠菌A600nm逐漸下降,在32.0 mg·mL-1時,菌液A600nm為對照的0.048%,吸光值下降幅度達95%。表明蒲公英提取物對白念珠菌的抑制率可達95%,且隨著濃度增加,菌液A600nm下降幅度均大于95%。表明蒲公英提取物對白念珠菌的MIC值為32.0 mg·mL-1。
SEM 觀察發(fā)現(xiàn),對照組處理5 h 后,白念珠菌結(jié)構(gòu)完整,外觀飽滿,菌體成近乎橢圓形,表面光滑,折光性好(見圖3A ~C)。0.5×MIC樣品Ⅰ作用5 h 后的白念珠菌細(xì)胞表面基本和空白對照組一樣,但表面變得粗糙,折光性減弱(見圖3D ~F)。1.0×MIC樣品Ⅰ處理白念珠菌5 h后,多數(shù)白念珠菌細(xì)胞不再呈現(xiàn)橢球形,結(jié)構(gòu)基本完整,但表面有褶皺,部分菌體出現(xiàn)凹陷。表面比較粗糙,細(xì)胞體積開始縮?。ㄒ妶D3G ~I)。2.0×MIC樣品Ⅰ處理白念珠菌 5 h 后,全部白念珠菌細(xì)胞不再呈現(xiàn)橢球形,細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不規(guī)則,細(xì)胞明顯縮小,表面褶皺且極度粗糙,部分菌體出現(xiàn)嚴(yán)重凹陷,細(xì)胞膜破損,導(dǎo)致內(nèi)容物外泄(見圖3K、L);圖3J 顯示,全部白念珠菌細(xì)胞明顯縮小,表面褶皺、嚴(yán)重凹陷及細(xì)胞膜破損在圖片上不甚明顯,考慮是菌體細(xì)胞明顯縮小,在放大2000 倍時菌體形態(tài)變化掃描電鏡不能顯示出顯著性差異。綜上可知,樣品Ⅰ能夠使細(xì)胞體積縮小,結(jié)構(gòu)不對稱并且表面形成褶皺,從而破壞白念珠菌的正常形態(tài)。其原因可能是由于細(xì)胞內(nèi)容物的大量外泄使得白念珠菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜凹陷,形成褶皺。
圖3 白念珠菌的SEM 圖像Fig 3 SEM images of C.albicans
微生物生長包括四個時期:緩慢期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。樣品Ⅰ對白念珠菌生長周期的抑制可根據(jù)生長曲線中的指數(shù)期進行分析。白念珠菌對數(shù)生長期的動力學(xué)方程可表示為[13]:
其中,μ是生長速率,N為t時刻的微生物數(shù)量。
假設(shè)微生物的比生長速率為一個常數(shù),
抑菌動力學(xué)是通過繪制白念珠菌的抑制生長曲線來研究抗菌性能。樣品Ⅰ對白念珠菌生長曲線的影響如圖4 所示,由圖4 可知,空白對照組的菌體生長狀態(tài)良好,當(dāng)加入樣品Ⅰ后,菌液的光密度值降低,表明樣品Ⅰ對白念珠菌有較好的抑制作用。當(dāng)樣品Ⅰ濃度為1.0×MIC時A600nm隨時間有明顯變化,樣品濃度為3.0×MIC時A600nm變化不大,表明白念珠菌生長受到嚴(yán)重抑制,樣品Ⅰ對白念珠菌的抑菌作用增強。分析樣品Ⅰ對白念珠菌生長速率及白念珠菌的抑制率發(fā)現(xiàn)(見表1),正常情況下白念珠菌的比生長速率為0.05,分別加入1.0×MIC和 3.0×MIC的樣品Ⅰ后,其生長速率則分別減小到0.02 和0.00,加入3.0×MIC樣品Ⅰ后白念珠菌基本不生長,其抑制率達到了97.13%。由此可知樣品Ⅰ對白念珠菌的抑制作用主要是作用于其對數(shù)期的生長,使白念珠菌的生長速度大幅度的降低,而抗菌效果取決于樣品Ⅰ的濃度和作用時間[10]。
圖4 三種濃度的樣品Ⅰ對白念珠菌的抑菌曲線Fig 4 Antibacterial curves of three concentrations of sampleⅠ on C.albicans
表1 C.albicans 在不同濃度樣品Ⅰ中的抑制率及比生長速率(對數(shù)生長期)Tab 1 Inhibition rate and growth rate of C.albicans in different concentrations of sampleⅠ(logarithmic growth phase)
正常情況下,完整的細(xì)胞膜選擇性通透,會阻擋胞內(nèi)大分子物質(zhì)外流。而當(dāng)導(dǎo)致膜損傷的殺菌劑存在時,殺菌劑會破壞細(xì)胞膜,本來不能透過細(xì)胞膜的具有紫外吸收的核酸類物質(zhì)便泄漏到培養(yǎng)液中,導(dǎo)致培養(yǎng)液在260 nm 處的吸光度值增大。因此,通過測定培養(yǎng)液260 nm 處的吸光度值能夠預(yù)測菌體細(xì)胞膜的完整性。由圖5 可知,空白對照組(0×MIC)的培養(yǎng)液在260 nm 波長的紫外吸光值隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸增大,表明白念珠菌在培養(yǎng)過程中伴隨細(xì)胞膜破壞,菌體的死亡。分別加入0、0.5、1.0、2.0×MIC的樣品Ⅰ后,培養(yǎng)液的紫外吸收值也隨著培養(yǎng)時間的增加而增大,且都表現(xiàn)出在同一時間高于對照組的現(xiàn)象,且有些達到了顯著水平。這表明蒲公英樣品Ⅰ損壞了白念珠菌細(xì)胞膜,導(dǎo)致膜的通透性增加,進而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
圖5 三種濃度的樣品Ⅰ對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig 5 Influence of samplesⅠ at three concentrations on cell permeability of C.albicans
白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分是己糖或氨基己糖,對于維持細(xì)胞形態(tài)和胞內(nèi)高滲狀態(tài)起著重要作用。白念珠菌細(xì)胞膜主要由磷脂類、鞘脂類和麥角甾醇等組分構(gòu)成,是一種滲透屏障,是小分子和信號傳導(dǎo)的通路,并為各種功能蛋白提供基質(zhì)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對完成胞內(nèi)外物資交換、營養(yǎng)物質(zhì)吸收和生物合成等方面起重要作用,這些結(jié)構(gòu)一旦被破壞,其功能作用喪失,將導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡[14]??拐婢幬锏淖饔脵C制包括作用于真菌細(xì)胞膜中甾醇合成、作用于真菌細(xì)胞壁合成、作用于核酸合成,其實質(zhì)都是破壞菌體的超微結(jié)構(gòu)。本文研究發(fā)現(xiàn)蒲公英提取物可以破壞白念珠菌的細(xì)胞膜,可能是其抗真菌活性的抑菌機制。但是,對中藥抗白念珠菌作用機制的研究,不應(yīng)該只局限于電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化和對白念珠菌的宏觀影響上,應(yīng)從分子水平上探討中藥活性成分是如何作用于這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)并使其發(fā)生改變,尤其是對生物膜主要成分合成酶的影響,分離酶基因從基因?qū)用娼沂局兴幙拐婢饔脵C制。
White 等[15]研究發(fā)現(xiàn),白念珠菌在受到外界環(huán)境的抑制時,其編碼目標(biāo)酶ERG11基因會發(fā)生改變改變,而細(xì)胞外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1會過表達進而菌體死亡。Denning[16]研究發(fā)現(xiàn),從溶菌芽孢桿菌C3 分離得到的酰胺B(ATB)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,ATB 通過抑制細(xì)胞G2/M 期細(xì)胞周期停滯的微管蛋白聚合而發(fā)揮作用的。表面活性劑對白念珠菌的作用,主要是對菌絲發(fā)育、細(xì)胞膜形態(tài)有強烈的影響,這種影響與肌動蛋白骨架的異常組織和隨后的菌絲相關(guān)因子的極化轉(zhuǎn)運缺陷有關(guān)[17]。細(xì)胞壁β-葡聚糖在白念珠菌生長過程中起到了重要作用[18-19]??ú捶覂敉ㄟ^抑制白念珠菌細(xì)胞壁β-葡聚糖的合成,從而達到抑制白念珠菌增長的目的[20]。本研究分析了樣品Ⅰ對白念珠菌的MIC值為32.0 mg·mL-1。抑菌動力學(xué)方程分析發(fā)現(xiàn)樣品Ⅰ對白念珠菌的抑制作用主要是作用于其指數(shù)生長期。樣品Ⅰ可破壞白念珠菌細(xì)胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞表面凹陷,形成褶皺。細(xì)胞膜通透性分析發(fā)現(xiàn),樣品Ⅰ導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄。這進一步表明蒲公英提取物是通過作用于白念珠菌細(xì)胞的細(xì)胞壁,通過破壞細(xì)胞壁進而導(dǎo)致內(nèi)容外泄而引起細(xì)胞凋亡的。
雖然在中藥抗白念珠菌的研究方法和作用機制方面已經(jīng)取得了不少進展,但仍然存在諸多未知領(lǐng)域,需要進一步深入探討,為真菌疾病的治療提供新的選擇。