三種快速檢測大黃炭炮制程度的光譜技術的比較

徐茂玲，孫靜，楊麗，陳建波（.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院藥劑科，天津 30005；.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 0488；3.北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 0488）

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumofficinaleBaill.的根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經、利濕退黃等功效[1]，是苦寒中藥的典型代表。為了緩和生品的苦寒之性、減輕峻烈的瀉下作用，大黃經常被炮制為各種飲片，例如酒大黃、熟大黃、大黃炭、清寧片等[2-3]。其中，大黃炭具有涼血化瘀止血的功效，常用于血熱有瘀出血癥[1]，對于上消化道出血、慢性炎癥性腸病、慢性腎衰竭等急重癥和難治疾病也有顯著療效[3-5]。大黃炭炮制不足時，苦寒藥性不能有效緩和；炮制過度時，藥效物質嚴重損失，還可能生成新的毒性成分。因此，精確控制炮制程度，準確評價飲片質量，才能保證大黃炭臨床使用的安全性、有效性與一致性。

現(xiàn)行《中國藥典》規(guī)定大黃炭總蒽醌含量不低于0.90%，游離蒽醌含量不低于0.50%[1]。本課題組在前期調研中發(fā)現(xiàn)，不同飲片企業(yè)的大黃炭炮制工藝差異很大，炮制溫度在180 ～400 ℃，炮制時間在5 ～50 min；不同企業(yè)或不同批次產品的總蒽醌含量最高相差3 倍，游離蒽醌含量最高相差5 倍；與各自使用的大黃藥材相比，不同企業(yè)的大黃炭飲片的總蒽醌、游離蒽醌及結合蒽醌含量變化各異。由此可見，目前市場上大黃炭炮制程度與化學成分差異很大，現(xiàn)行標準難以保證飲片質量一致性。這種現(xiàn)象在大黃炭研究領域也有體現(xiàn)，雖然文獻報道一致認為大黃炒炭后結合蒽醌、番瀉苷等含量降低，但是游離蒽醌與沒食子酸含量變化結論不一致[6-9]。

本課題組前期研究表明，大黃炭活性成分在炮制過程中存在單向變化與雙向變化兩種模式[10-11]：結合蒽醌、番瀉苷等含量隨炭化程度增加而持續(xù)減少，游離蒽醌、沒食子酸、5-羥甲基糠醛等含量表現(xiàn)出先增后減的規(guī)律。造成生產和科研中大黃炭與大黃藥材游離蒽醌含量相對高低混亂主要是因為目前大黃炭炮制終點指標不夠明確、合理，導致飲片炮制程度不一致。雖然有研究表明游離蒽醌含量增加有利于提高大黃炭的抗炎、抗氧化活性[12-13]，但是游離蒽醌含量達到極大值時大黃炭抗炎活性并非最高[13]，性狀特征也與傳統(tǒng)經驗標準有所區(qū)別[11，14]。這也說明，大黃炭藥效物質與作用機制還需要繼續(xù)深入研究，不能簡單將游離蒽醌含量達到極大值作為大黃炭炮制的終點指標。

顏色是目前大黃炭炮制終點判斷的關鍵經驗指標?，F(xiàn)行藥典規(guī)定生大黃外表皮“黃棕色或棕褐色”、切面“黃棕色至淡紅棕色”，而大黃炭應炒至“表面焦黑色，內部焦褐色”[1]。各省級中藥飲片炮制規(guī)范也采用顏色作為大黃炭的質量指標之一，飲片表面描述為炭黑色、黑褐色、焦褐色不等，內部描述為棕褐色、深褐色、深黃色不等。這表明大黃炭終點顏色判斷具有相當?shù)哪：耘c波動性。有研究使用數(shù)碼相機表征不同溫度、不同時間炮制的大黃炭飲片及其粉末的紅綠藍值（RGB 值）[15]，表明客觀量化的顏色數(shù)值有利于提高判斷結果的可控性。大黃粉末顯微特征主要為草酸鈣晶體、淀粉粒和導管，研究表明炒炭后草酸鈣簇晶數(shù)量降低、破碎程度增加，淀粉粒復粒減少、部分糊化與炭化，導管數(shù)量減少、部分呈棕黃色或者炭化[16]。上述結果表明，除了蒽醌等有機小分子，顏色、有機和無機基質成分也有可能作為大黃炭炮制終點的客觀量化指標。

在前期研究中，本課題組綜合使用顏色指標、有機小分子指標、有機大分子和無機物指標將不同溫度、不同時間烘制的大黃炭劃分為不同炮制程度組[11]。這種做法雖然可以獲得較為充分的炮制程度評價參數(shù)，但是檢驗工作量大，物質和時間成本較高。因此，本研究嘗試使用可見光譜、近紅外光譜（NIR）、中紅外光譜（MIR）建立簡便快速的大黃炭炮制程度評價方法，在保證大黃炭臨床使用安全性、有效性與一致性的前提下，盡可能降低檢測成本、提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料及其炮制

大黃藥材采集于甘肅省甘南州卓尼縣，經中國中藥協(xié)會張世臣教授鑒定為蓼科植物唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.的干燥根和根莖。實驗室烘箱預熱到設定烘制溫度后，平鋪放入約100 g 大黃藥材片（厚度4 ～6 mm），立即開始計時，到設定烘制時間后取出放涼。大黃藥材片在180、200、220 和240 ℃分別烘制10、20、30、40、50、60 min，在280℃和320℃分別烘制10、20、30 min，共制備30 份不同炮制程度的大黃炭片?？梢姽庾V與NIR 測試直接使用大黃藥材與大黃炭片，MIR 測試使用通過藥典四號篩的大黃藥材與大黃炭粉末。

1.2 可見光譜測試

樣品可見光譜測試使用Lambda 950 UV/Vis/NIR 分光光度計（美國PerkinElmer 公司），配有150 mm 插入式積分球附件。大黃藥材與大黃炭片直接置于積分球反射測量窗口，可見光譜掃描范圍380 ～780 nm，狹縫寬度4 nm，數(shù)據(jù)點間隔10 nm，積分時間1 s。使用Spectralon 參考白板（美國Labsphere 公司）進行光譜背景校正。每個樣品取樣3 次進行測試，取平均值，以反射率為光譜縱坐標。

1.3 NIR 測試

樣品NIR 測試所用儀器為Frontier FT-IR/NIR 紅外光譜儀（美國PerkinElmer 公司），配有外置式近紅外積分球附件。大黃藥材與大黃炭片直接置于積分球反射測量窗口，光譜掃描范圍10 000 ～4000 cm－1，光譜分辨率16 cm－1，每張光譜累加掃描32 次。使用Spectralon 參考白板進行光譜背景校正。每個樣品取樣3 次進行測試，取平均值以反射吸光度為光譜縱坐標。

1.4 MIR 測試

樣品MIR 測試所用儀器為Frontier FT-IR/NIR 紅外光譜儀，配有內反射晶體為金剛石的通用型衰減全反射附件（ATR 附件）。大黃藥材與大黃炭粉末直接置于ATR 附件的內反射晶體表面，用裝置自帶壓桿保證大黃粉末與晶體表面緊密接觸[壓力顯示值為（140±5）]，光譜掃描范圍4000 ～650 cm－1，光譜分辨率4 cm－1，每張光譜累加掃描16 次。使用空氣進行光譜背景校正，掃描過程中自動扣除水蒸氣和二氧化碳干擾，掃描完成后對光譜強度進行ATR 校正（接觸因子設為0）。每個樣品取樣3 次進行測試，取平均值以吸光度為光譜縱坐標。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

可見光譜、NIR、MIR 的基本譜圖數(shù)據(jù)處理使用Spectrum v10.4 軟件（美國PerkinElmer 公司），PCA 分析使用MATLAB R2016b 軟件（美國The MathWorks 公司），SIMCA 建模使用Assure-ID v4.2 軟件（美國PerkinElmer 公司）。

2 結果

2.1 基于粉末色度與化學成分的大黃炭炮制程度分組

本研究所用31 份大黃藥材與不同炮制程度大黃炭樣品粉末的顏色指標（色差儀測量的L*、a*、b*色度值）、有機小分子指標（高效液相色譜測量的結合蒽醌、游離蒽醌、番瀉苷、沒食子酸、5-羥甲基糠醛等14 種成分含量）、有機大分子和無機物指標（紅外光譜反映的淀粉、纖維素、草酸鈣等成分信息）參考文獻[11]。樣品按照炮制程度分組時，首先根據(jù)藥典與炮制規(guī)范關注的表面與斷面顏色，分為表里均未變黑、只有表面變黑、表里均已變黑的3 個水平；然后根據(jù)游離蒽醌含量水平，將表里均未變黑的樣品再分為游離蒽醌含量相對于大黃藥材沒有明顯變化、有明顯增加的兩類?；谏鲜龇椒?，所有樣品按照炭化程度從輕到重可以劃分為G1、G2、G3、G4 四組（代表性樣品如圖1 所示）。

圖1 不同炮制程度大黃炭的代表性樣品Fig 1 Typical samples of rhubarb charcoal processed to different degrees

① G1 組包含原藥材、180 ℃烘10 ～60 min、200℃烘10 ～30 min、220℃烘10 ～20 min、240 ～320 ℃烘10 min 共15 個樣品，這些樣品表面顏色沒有明顯變深，結合蒽醌與番瀉苷含量較高，游離蒽醌、沒食子酸與5-羥甲基糠醛含量較低，纖維素、淀粉等有機大分子較多；

② G2 組包含200 ℃烘40 ～60 min、220℃烘30～50 min、240℃烘20～30 min 共8個樣品，這些樣品表面顏色加深但是沒有變黑，結合蒽醌與番瀉苷含量較低，游離蒽醌、沒食子酸與5-羥甲基糠醛含量較高，纖維素、淀粉等有機大分子減少；

③ G3 組包含220℃烘60 min、240℃烘40 min、280℃與320℃烘20 min 共4 個樣品，這些樣品表面變黑、斷面尚未變黑，結合蒽醌與番瀉苷含量極低，游離蒽醌、沒食子酸與5-羥甲基糠醛含量較低（與G1 組相當），纖維素、淀粉等有機大分子進一步減少；

④ G4 組包含240 ℃烘50 ～60 min、280℃與320℃烘30 min 共4 個樣品，這些樣品表面與斷面均變黑，幾乎不含結合蒽醌、番瀉苷、游離蒽醌、沒食子酸與5-羥甲基糠醛等有機小分子，也幾乎不含纖維素、淀粉等有機大分子，部分草酸鈣分解為碳酸鈣。

根據(jù)上述各組樣品的顏色與成分特征，基本可以確定G1 組炮制程度為“不及”、G4 組炮制程度為“太過”，而G2 組和G3 組炮制程度是否“適中”還需進一步的藥效實驗確定。

2.2 不同炮制程度大黃炭的可見光譜分析

已有研究使用色差儀等檢測飲片顏色，但通常需要將樣品制成粉末，而片狀或塊狀飲片樣品的直接分析有利于提高檢測效率，還可能實現(xiàn)炮制過程的原位監(jiān)測。難點在于，中藥飲片表面一般是粗糙且不平整的，所以各角度均存在反射光線且比例不固定。本研究使用高性能的可見光譜儀和積分球，盡可能充分收集飲片表面反射光線，可以提高光譜測量精度，使片狀或塊狀中藥飲片樣品可直接置于積分球的反射測量窗口進行測試。

如圖2 所示，炮制程度較輕的G1 組大黃炭飲片在可見光的長波長側反射率較高，與該組飲片表面主要為黃棕色的性狀特征是相符的。隨著炮制程度的增加，大黃炭飲片表面反射率不斷下降，最后基本不反射可見光，這對應于大黃炭飲片表面顏色逐漸加深，最終變?yōu)楹谏?。?80 ～780 nm 內的不同炮制程度大黃炭可見光譜進行主成分分析（PCA），結果第一主成分解釋了98.3%的光譜方差，第二主成分解釋了1.1%的光譜方差。如圖3 所示，不同炮制程度大黃炭可見光譜差異集中體現(xiàn)在主成分1 上，而主成分2 對于炮制程度鑒別幾乎沒有意義。也就是說，大黃炭炮制程度變化引起的可見光譜不同波長處變化是高度相關的，理論上一個參數(shù)（例如主成分1 得分或者單波長反射率）就能反映不同炮制程度大黃炭可見光譜幾乎全部差異。

圖3 不同炮制程度大黃炭的可見光譜主成分得分圖Fig 3 PCA score plot of the visible spectra of rhubarb charcoal processed to different degrees

2.3 不同炮制程度大黃炭的NIR 分析

如圖2 和圖4 所示，大黃炭的炮制程度增加時，可見光譜的長波長側反射率逐漸下降，NIR的高波數(shù)側反射率也逐漸下降（即反射吸光度逐漸上升）。此外，大黃炭的炮制程度增加時密度逐漸降低（質變輕），也可能影響NIR 的基線形狀。所以，隨著炮制程度的增加，大黃炭NIR 的高波數(shù)側反射吸光度逐漸上升，且基線傾斜程度越來越大。如圖4 所示，隨著炮制程度的增加，大黃炭NIR 的低波數(shù)側反射吸光度逐漸降低，吸收峰數(shù)目減少、位置移動，說明大黃炭炮制程度增加時的有機物種類變化與含量降低。

圖2 不同炮制程度大黃炭的平均可見光譜Fig 2 Average visible spectra of rhubarb charcoal processed to different degrees

圖4 不同炮制程度大黃炭的平均近紅外光譜Fig 4 Average NIR spectra of rhubarb charcoal processed to different degrees

10 000 ～4000 cm－1內的不同炮制程度大黃炭NIR 的PCA 分析結果顯示，第一主成分解釋了89.2%的光譜方差，第二主成分解釋了10.3%的光譜方差。也就是說，至少兩個參數(shù)（例如主成分1與主成分2 的得分）才能充分解釋大黃炭炮制程度變化引起的NIR 差異。如圖5 所示，主成分1 和主成分2 讓大黃炭炮制程度呈現(xiàn)明顯的拐點，便于在四組炮制程度明顯不同的大黃炭樣品之間劃出明確的邊界線，有利于大黃炭炮制程度的鑒別。

圖5 不同炮制程度大黃炭的近紅外光譜主成分得分圖Fig 5 PCA score plot of the NIR spectra of rhubarb charcoal processed to different degrees

2.4 不同炮制程度大黃炭的MIR 分析

如圖6 所示，G1 組大黃炭的MIR 上3330 cm－1與2925 cm－1附近分別是O-H 與C-H 伸縮振動吸收峰，是各種有機成分的普遍特征峰；1607 cm－1、1514 cm－1與1445 cm－1是苯環(huán)骨架振動吸收峰，但是1607 cm－1還包含了草酸鈣C ＝O 伸縮振動吸收，而1445 cm－1還包含了一些有機成分的C-H 彎曲振動吸收；1365 cm－1是C-H 彎曲振動吸收峰；1315 cm－1與后面779 cm－1是草酸鈣特征峰；1235 cm－1和1145 cm－1主要是苷鍵、酯鍵等的C-O 伸縮振動吸收峰；1024 cm－1附近主要是相互疊加的大分子和小分子糖類的C-O 伸縮振動吸收峰，來自纖維素、淀粉等多種有機成分的貢獻；824 cm－1與767 cm－1是較弱的碳骨架振動吸收峰。炮制程度增加時，3000 cm－1與1000 cm－1附近的有機物吸收峰逐漸降低，而1610 cm－1、1315 cm－1與780 cm－1附近的草酸鈣特征峰相對穩(wěn)定。G3 和G4 組大黃炭在3000 cm－1附近的吸收峰主要來自草酸鈣中結晶水的O-H 伸縮振動吸收。

圖6 不同炮制程度大黃炭的平均中紅外光譜Fig 6 Average MIR spectra of rhubarb charcoal processed to different degrees

G1 組與G2 組大黃炭飲片在MIR 中的一個重要差異是1145 cm－1附近的吸收峰，在加熱到一定程度后會藍移至1150 cm－1以上。這一規(guī)律在相關研究中均有呈現(xiàn)[11，13，17]，說明該吸收峰可能是判斷大黃炭飲片炮制程度是否為“不及”的重要指標。G2 組與G3 組大黃炭飲片在MIR中的直觀差異是后者在3000 cm－1與1000 cm－1附近的有機物吸收峰明顯低于草酸鈣特征峰。G3組與G4 組大黃炭飲片MIR 的直觀差異除了后者在1000 cm－1附近的有機物吸收峰幾乎消失，還在1438 cm－1和876 cm－1附近出現(xiàn)了碳酸鈣特征峰（草酸鈣分解所致）——這可能是判斷大黃炭飲片炮制程度是否為“太過”的重要指標。綜上，四組炮制程度明顯不同的大黃炭樣品的MIR具有可以直觀發(fā)現(xiàn)的鑒別特征峰。

4000 ～650 cm－1內的不同炮制程度大黃炭MIR 的PCA 分析結果顯示，第一主成分解釋了88.5%的光譜方差，第二主成分解釋了8.5%的光譜方差。也就是說，至少兩個參數(shù)（例如主成分1與主成分2 的得分）才能充分解釋大黃炭炮制程度變化引起的MIR 差異，這與上述MIR 反映大黃炭多類有機和無機成分變化的觀點相吻合。如圖7 所示，主成分1 和主成分2 有利于大黃炭炮制程度的鑒別，但是G1 組與G2 組一些樣品較為相似，G3組和G4 組樣品分布較為離散，可能是因為MIR 反映的成分信息過于繁細、無機成分權重較大，反而不利于四組大黃炭樣品之間明確邊界的劃分。

圖7 不同炮制程度大黃炭的中紅外光譜主成分得分圖Fig 7 PCA score plot of the MIR spectra of rhubarb charcoal processed to different degrees

2.5 基于有監(jiān)督模式識別的大黃炭炮制程度的光譜判斷

使用光譜指紋圖譜對中藥進行自動鑒別需要建立相應的有監(jiān)督模式識別方法。本研究使用基于PCA 的SIMCA 分類模型，分別建立了大黃炭飲片炮制程度的可見光譜、NIR、MIR 識別模型?？梢姽庾V模型使用的光譜范圍為380 ～780 nm，光譜強度不進行任何歸一化處理。NIR 模型使用的光譜范圍為10 000 ～4000 cm－1，光譜強度使用標準正態(tài)變量（SNV）進行歸一化處理。MIR 模型使用的光譜范圍為4000 ～650 cm－1（扣除沒有樣品吸收信號且ATR 附件噪聲較大的2800 ～1800 cm－1區(qū)域），光譜強度使用SNV 進行歸一化處理。所有模型的類邊界顯著性水平為0.05。模型使用交叉驗證，同組樣本作為陽性樣本，其他組樣本作為陰性樣本。

如表1 所示，三種光譜模型的大黃炭不同炮制程度組的識別率（正確識別組內樣品的比例）均為100%，即假陰性概率為0。NIR 模型的所有組的拒絕率（正確拒絕組外樣品的比例）也均為100%，即假陽性概率為0。MIR 模型的所有組的拒絕率均高于90%，而可見光譜模型的最低拒絕率只有73%。也就是說，NIR 模型對于不同炮制程度大黃炭的鑒別結果最準確，MIR 模型也基本能夠準確鑒別，但是可見光譜模型的錯判概率較高。三種光譜模型的準確度相對高低與前面PCA 得分圖（見圖3、5、7）顯示的聚類明顯程度相符。

表1 不同炮制程度大黃炭的光譜SIMCA 模型準確率Tab 1 Accuracy of the spectral SIMCA models of rhubarb charcoal processed to different degrees

3 討論

雖然可見光譜能夠客觀量化地表征大黃炭飲片表面顏色變化，但是單調減少的反射率用于區(qū)分不同炮制程度大黃炭時存在一定的困難。如圖3 所示，四組炮制程度明顯不同的大黃炭樣品在可見光譜主成分1 上的得分是連續(xù)分布的，很難在四組樣品之間劃出明確的邊界線?？紤]到不同大黃藥材的表面顏色本身就存在很大的波動，將可見光譜用于源自不同大黃藥材的大黃炭飲片炮制程度的橫向比較仍有很大的不確定性。

NIR 區(qū)域的高波數(shù)端一般不低于10 000 cm－1（波長不長于1 μm），非常接近可見光譜區(qū)域的長波長側（780 nm）。樣品可見光譜的長波長側存在明顯差異時，其NIR 的高波數(shù)側也會受到影響。除了顏色變化，樣品的密度、粗糙度等發(fā)生變化時，也可能表現(xiàn)為NIR 的基線變化。NIR的低波數(shù)側主要為C-H、O-H 等含氫原子有機官能團的倍頻與合頻吸收峰。因此，與可見光譜相比，NIR 不僅能反映炮制程度對大黃炭飲片性狀的影響，還能反映炮制程度對大黃炭飲片成分的影響。但是，NIR 非常依賴于數(shù)學模型，樣品離散度過大（例如不同企業(yè)用不同藥材、不同工藝制備的大黃炭飲片）可能降低模型準確性。

NIR 主要體現(xiàn)的是含氫原子的有機官能團的倍頻與合頻峰，而MIR 主要體現(xiàn)的是含氫原子與不含氫原子的有機與無機官能團的基頻峰，所以MIR 的吸收峰數(shù)量更多、峰形更窄，因而指紋特征性更強，涵蓋了更多有機與無機成分的結構與含量信息。在不依賴于數(shù)學模型的環(huán)境下，MIR用于物質鑒別具有很好的耐用性與可靠性。因此，MIR（一般簡稱為“紅外光譜”）是國際慣用的化學藥物鑒別標準方法，理論上也可作為中藥飲片炮制程度鑒別的標準方法之一。然而，MIR 測試固體樣品時通常需要制成粉末（粉末可直接檢測而無需溴化鉀壓片），不能用于片狀或塊狀中藥飲片樣品的直接測試，所以在固體樣品的測試速度與過程監(jiān)測方面略遜于NIR。再者，有些情況下樣品的MIR 信息太過豐富而復雜難解，有用信號與無用信號混合在一起，反而可能增加模式識別的困難。

4 結論

明代陳嘉謨《本草蒙筌》指出“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失”，說明了炮制終點判斷對于中藥飲片質量控制的重要性。漢代張仲景《金匱要略》已經提出“燒灰存性，勿令灰過”的炭藥炮制終點判斷原則，但是各種炭藥“存性”的具體指標尚需深入研究。性狀與顯微結構等形性指標、指標成分與指紋圖譜等化學指標、活性效價與限度等生物指標是中藥質量評價最常用的幾類指標。在大部分藥效物質和作用機制不夠明確的情況下，“形性-化學-生物”三性指標有機結合可以更全面地體現(xiàn)飲片質量，更準確地判斷炮制終點[18-19]。然而，綜合指標的全面檢測需要較高的時間和物質成本。所以，建立簡便、快速的炮制程度評價方法，對于中藥飲片的終點判斷與質量控制也是非常必要的。

本研究初步比較了可見光譜、NIR、MIR 用于大黃炭炮制程度快速檢測的可行性與準確性。結果表明，大黃炭炮制程度增加時可見光譜單調變化（不同波長處的反射率均下降且高度相關），不同炮制程度組之間難以劃清界限。NIR 與MIR反映的樣品信息更加豐富，能夠顯示大黃炭炮制程度增加時存在的拐點，對于不同炮制程度組的鑒別結果較為準確。NIR 能夠直接檢測大黃切片，所以在大黃炭炮制程度快速評價與炮制過程在線監(jiān)測方面具有較好的應用潛力。MIR 需要檢測大黃粉末，在檢測速度上略遜于NIR，也難以用于炮制過程的在線分析。但是在不依賴于數(shù)學模型的條件下，MIR 可以根據(jù)多種有機與無機成分的特征峰直觀區(qū)分不同炮制程度的大黃炭，因此可以作為大黃炭炮制終點的標準鑒別指標之一，補充性狀鑒別（或顯微鑒別）與色譜鑒別之間的缺失信息——未被色譜檢測的大分子、無機物等的化學特征。