苯并芘促進FHIT、CDH13基因啟動子區(qū)甲基化及機制研究

武岳，張夢迪，李君，王冬雪，白圖雅，呂曉麗，胡玉霞，高峰，周樹宏，李京慧，范興業(yè)，常福厚，王光*（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 0000；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，呼和浩特 000；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 000；5.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 000；6.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院，上海 00）

肝癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的發(fā)病率和病死率均居世界首位[1]。肝癌的發(fā)生也和其他腫瘤一樣是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，已有研究表明腫瘤相關(guān)基因啟動子異常甲基化可以作為腫瘤發(fā)生的敏感生物標(biāo)志物[2-3]。

DNA 甲基化為DNA 化學(xué)修飾的一種形式，能夠在不改變DNA 序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。脆性組氨酸三聯(lián)體（fragile histidinetriad，F(xiàn)HIT）基因是一個抑癌基因[4]。T-鈣黏蛋白（T-cadherin/H-cadherin，CDH13）是非典型的鈣黏素家族中的一員[5]。研究表明FHIT、CDH13可能成為惡性腫瘤風(fēng)險評估和監(jiān)測預(yù)后的新的分子生物學(xué)標(biāo)志物[6]。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)FHIT、CDH13基因甲基化在肝癌患者中高表達，提示FHIT、CDH13基因甲基化可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[7]。

苯并芘[benzo(a)pyrene，BaP]是一種常見的環(huán)境污染物。在流行病學(xué)研究中，環(huán)境中高水平的BaP 暴露會增加肝細胞癌（human hepatocellular carcinoma，HCC）的風(fēng)險，表明BaP 可能是誘發(fā)HCC 的原因之一[8]。但是關(guān)于BaP 作用于HepG2細胞對FHIT、CDH13基因啟動子區(qū)甲基化的影響尚未見報道。本研究選取DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）作為陽性對照，通過MSP 法檢測BaP 對FHIT、CDH13基因甲基化的情況，同時采用RT-qPCR 和Western blot 法檢測BaP 對FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 mRNA 和蛋白表達的影響并對其機制進行初步探討，為肝癌分子標(biāo)記物的篩選及致癌機制的探討提供參考。

1 材料

BaP（美國Sigma 公司），DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco 公司），DNA 提取酚試劑（中國Solarbio 公司），5-Aza-CdR（中國上海源葉公司），EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒（中國南京博爾迪生物有限公司），甲基化特異性PCR 試劑盒（中國天根生化科技有限公司），F(xiàn)HIT、CDH13、DNMT1、Sp1 和β-actin 兔單克隆抗體（英國Abcam 公司），RevertTra Ace qPCR RT kit、SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒（日本TOYOBO 公司）。人肝癌細胞株HepG2（北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及處理

人肝癌HepG2 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，當(dāng)細胞達到80%～90%融合時，胰蛋白酶消化制成細胞懸液后以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N于細胞培養(yǎng)6 孔板中并搖勻。選取DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR 作為陽性對照組，實驗分為對照組、陽性對照組及不同濃度BaP（0.1、1、10 μmol·L－1）組。分別用0.1、1、10 μmol·L－1BaP，5-Aza-CdR 處理細胞24 h，對照組不加任何藥物處理。然后收集細胞進行下一步的檢測實驗。

2.2 甲基化特異性PCR（MSP）法檢測FHIT、CDH13 基因甲基化情況

采用酚氯仿法提取DNA，根據(jù)DNA Methylation-Gold 試劑盒說明書對DNA 進行甲基化修飾，并進行擴增，擴增引物見表1，PCR 條件如下：變性（95 ℃，5 min），退火（94℃ 20 s、64℃ 30 s、72 ℃ 20 s，35 個循環(huán)），延伸（72 ℃10 min）。PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析，應(yīng)用UVP 凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

表1 MSP 中FHIT、CDH13 基因的引物序列、產(chǎn)物片段大小及退火溫度Tab 1 Primer sequences of FHIT and CDH13 genes in MSP，product fragment size and annealing temperature

2.3 熒光實時定量PCR（RT-qPCR）法檢測FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 mRNA 表達情況

將細胞按“2.1”項下方法處理后，收集細胞，按RNA 提取試劑盒提取細胞總RNA，使用Nanodrop2000 測定RNA 純度及濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。引物序列見表2，使用RT-qPCR 法進行擴增，反應(yīng)程序如下：95℃2 min，90℃ 20 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 50 s（40 個循環(huán)），采用2－△△CT法計算檢測基因mRNA 的相對表達量，實驗重復(fù)3 次。

表2 FHIT、CDH13、DNMT1 及Sp1 基因的引物序列Tab 2 Primer sequence of FHIT，CDH13，DNMT1，and Sp1 gene

2.4 Western blot 法檢測FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 蛋白表達情況

將細胞處理24 h 后，蛋白裂解液裂解細胞提取各組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，定量后進行 SDS-PAGE 垂直電泳，濕法PVDF 轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉20 min，在4℃下一抗（1∶5000）孵育過夜，TBST 清洗3 次，二抗避光孵育1 h，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測，掃描后應(yīng)用Image J軟件進行分析。

2.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料組間差異采用單因素方差分析法進行檢驗，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來表示，并采用Graphpad Prism 統(tǒng)計分析軟件作圖，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BaP 對FHIT、CDH13 基因甲基化的影響

FHIT基因擴增對接基因中原始序列的位置為：195—283（來自GenBank 序列號U76263），甲基化島5 個[9]。CDH13擴增對接基因中原始序列的位置為－265—－247，甲基化島6 個[10]。采用MSP 法檢測不同濃度的BaP（0、0.1、1、10 μmol·L－1）處理24 h 后的HepG2 細胞，結(jié)果顯示陽性對照組（5-Aza-CdR 組）中CDH13、FHIT基因呈現(xiàn)非甲基化狀態(tài)，隨著BaP 濃度增加，F(xiàn)HIT、CDH13基因甲基化條帶（M 條帶）亮度逐漸增強，而非甲基化條帶（U 條帶）亮度逐漸減弱，且均呈劑量依賴性，高劑量組呈現(xiàn)完全甲基化狀態(tài)（見圖1）。表明BaP可促進FHIT、CDH13基因啟動子區(qū)域的甲基化。

圖1 FHIT 基因（A）和CDH13 基因（B）MSP 電泳圖Fig 1 MSP electropherogram of FHIT genes (A) and CDH13 genes (B)

3.2 BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 mRNA 表達情況

將對照組中FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1mRNA 表達量設(shè)置為1，與對照組比較（見圖2），陽性對照組FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1mRNA及BaP 1 μmol·L－1和10 μmol·L－1組中FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1的表達差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001）。結(jié)果表明BaP 中、高劑量組可以顯著下調(diào)FHIT、CDH13mRNA 表達量，而上調(diào)DNMT1、Sp1mRNA 表達量。

圖2 不同濃度BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1 及Sp1 基因mRNA 表達的情況（n ＝3）Fig 2 mRNA expression of FHIT，CDH13，DNMT1 and Sp1 at different concentrations of BaP（n ＝3）

3.3 BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1、Sp1 蛋白表達情況

與對照組相比，BaP 0.1 μmol·L－1蛋白表達雖降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），陽性對照組表達顯著升高（P＜0.05）。BaP 1 μmol·L－1和10 μmol·L－1組較對照組FHIT、CDH13 蛋白表達顯著減低，而DNMT1、Sp1 蛋白表達顯著增加（見圖3）（P＜0.05）與RT-qPCR 結(jié)果一致。表明BaP 可能通過增加DNMT1、Sp1 蛋白表達而抑制FHIT、CDH13 蛋白表達。

圖3 不同濃度BaP 處理后FHIT、CDH13、DNMT1 及Sp1 基因蛋白表達的情況（n ＝3）Fig 3 Protein expression of FHIT，CDH13，DNMT1 and Sp1 at different concentrations of BaP（n ＝3）

4 討論

DNA 甲基化是重要的表觀遺傳修飾方式之一，參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、X染色體失活、基因組印記和染色體穩(wěn)定等多項生命活動[11]。近年來國內(nèi)外學(xué)者對FHIT、CDH13基因甲基化與肝癌的關(guān)系進行了大量的研究，研究表明FHIT、CDH13基因甲基化與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。此前，Tuoya 等[7]的實驗也證實了FHIT、CDH13基因在肝癌患者中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)。BaP 是國際公認(rèn)的環(huán)境污染物，被列為Ⅰ類致癌物，已有研究報道BaP 可以促進肝癌的發(fā)生和進展[13]，但其具體機制尚未清晰。Jiang 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，BaP 誘導(dǎo)的DNA 甲基化改變可能會導(dǎo)致與空氣污染相關(guān)肺癌中異常的DNA 甲基化，這些DNA 甲基化改變可能影響肺癌的發(fā)生和進展。本實驗以DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR 為陽性對照組，通過采用甲基化特異性PCR 法檢測不同濃度BaP 作用于HepG2細胞后FHIT、CDH13基因的甲基化情況，結(jié)果表明BaP 可增強FHIT、CDH13基因甲基化水平，且具有濃度依賴性，本實驗結(jié)果佐證了之前的研究內(nèi)容也彌補了的BaP 對HepG2 細胞內(nèi)的FHIT、CDH13甲基化水平的研究空白。

DNA 甲基化和去甲基化可通過DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）進行調(diào)控，兩個 DNMT 家族 DNMT3和 DNMT1 分別負責(zé)甲基化的建立和維持[15]。Robert 等[16-17]研究發(fā)現(xiàn)DNMT1 和DNMT3b 協(xié)同作用抑制腫瘤的CpG 島高甲基化。DNMT1 負責(zé)將己經(jīng)發(fā)生變化的基因DNA 甲基化信息傳遞于子代細胞，使得異常DNA 甲基化模式繼續(xù)發(fā)生和延續(xù)[18]。Leu 等[19]在卵巢癌的研究中，沉默DNMT1后3 個無活性TWIST、RASSF1A和HIN-1基因發(fā)生部分去甲基化，并恢復(fù)了基因的表達。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著BaP 濃度的升高，DNMT1 的蛋白及mRNA 表達逐漸增加，高劑量組BaP 對DNMT1蛋白及mRNA 表達增加最為明顯，但抑癌基因FHIT、CDH13無論是蛋白表達還是mRNA 表達都逐漸減少，表明BaP 可能通過顯著增加甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1 的活性使FHIT、CDH13表達減少，從而發(fā)揮促甲基化的作用。

DNMT1 活性的改變與其表達水平和功能性激活有關(guān)，其表達水平主要受核轉(zhuǎn)錄因子Sp1的調(diào)控。Song 等[20]研究發(fā)現(xiàn)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1 與Sp1 結(jié)合并引起一些Sp1靶基因的抑制，同時Sp1 還可以通過與DNMT1 相互作用而促進特定位點的甲基化[21]。為了進一步探究BaP 抑制DNMT1 表達的機制，采用RT-qPCR、Western blot 法對其進行驗證，結(jié)果表明BaP 暴露后，細胞中Sp1mRNA 與蛋白表達均顯著增高。有研究指出對DNMT1 的表達抑制機制可能是通過抑制Sp1 的活性而實現(xiàn)的[22]。由于Sp1 在DNMT1 上有結(jié)合位點，所以BaP 可能通過上調(diào)Sp1 蛋白與mRNA 的表達發(fā)揮促進作用，可能最終會導(dǎo)致DNMT1 的活性增強，從而促進FHIT、CDH13基因甲基化作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BaP 可能會通過增強Sp1 促進DNMT1 活性，調(diào)控FHIT、CDH13基因甲基化表達，影響FHIT、CDH13基因的表達水平，從而發(fā)揮促甲基化作用。但BaP 如何調(diào)控Sp1和DNMT1 及其下游信號通路有待進一步研究。