嘉定梅山豬氣喘病的血液生理生化及免疫指標(biāo)檢測(cè)分析

涂尾龍，吳華莉，張鶯鶯，王洪洋，黃 濟(jì)，曹建國，衛(wèi)金良，甘葉青，唐賽勇，談?dòng)浪?

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106；3.上海市嘉定區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201800）

梅山豬是我國南方太湖流域具有高產(chǎn)仔數(shù)特性的地方品種，曾經(jīng)被譽(yù)為生豬產(chǎn)仔冠軍，其肉質(zhì)鮮美［1］。目前梅山豬有4個(gè)保種場(chǎng)：上海市嘉定區(qū)梅山豬育種中心、昆山市種豬場(chǎng)、江蘇農(nóng)林職業(yè)學(xué)院及太倉市種豬場(chǎng)。按體型大小分為中梅山豬和小梅山豬，嘉定梅山豬屬于中梅山豬。氣喘病（Enzootic Pneumonia， EP）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma Hyopneumoniae， Mhp）引起的豬支原體肺炎，具有高度傳染性、致病率和低死亡率［2］。嘉定梅山豬時(shí)有氣喘病發(fā)生，尤其是在寒冷冬季或季節(jié)交替的時(shí)節(jié)，會(huì)給豬場(chǎng)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。即使在有免疫后，仍有部分豬發(fā)病，難以根除。2017年，朱效俊等［3］在研究不同支原體疫苗對(duì)梅山豬氣喘病的影響中發(fā)現(xiàn)，支原體疫苗瑞倍適免疫過的梅山豬，50日齡的梅山豬抗體陽性率為50%，160日齡的梅山豬抗體陽性率為55.56%，免疫效果并不佳。本研究以嘉定梅山豬為試驗(yàn)對(duì)象，在冬季氣喘病高發(fā)時(shí)，檢測(cè)氣喘病發(fā)作的梅山豬血液中血常規(guī)、生理生化及免疫指標(biāo)，分析并找出其差別。并以此為標(biāo)準(zhǔn)，在各個(gè)季節(jié)對(duì)梅山豬群體進(jìn)行篩選，找出梅山豬氣喘病的潛在群體，進(jìn)行采樣，為進(jìn)一步篩選梅山豬氣喘病的相關(guān)基因及基因表達(dá)量的規(guī)律提供參考，從而更好地指導(dǎo)梅山豬篩選抗氣喘病豬的選育工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

上海市嘉定區(qū)梅山保種場(chǎng)，純種梅山豬60頭，其中30頭具有氣喘病癥狀， 30頭正常。

1.2 血液采集

使用醫(yī)用的采血管和采血針，前腔靜脈采集血液10 mL，分裝2管：1管為加抗凝劑，用于檢測(cè)血常規(guī)指標(biāo)；另外1管不加抗凝劑，用于離心，提取血清，用于檢測(cè)生化、脂肪代謝、微量元素和免疫等指標(biāo)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 血常規(guī)指標(biāo) 使用邁瑞B(yǎng)C-30全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)梅山豬的血常規(guī)指標(biāo)，包括：白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞比積（HCT）、平均紅細(xì)胞容積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差（RDW-SD）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）、血小板分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）、血小板大細(xì)胞比率（P-LCR）、血小板比容（PCT）、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值（NEUT）、淋巴細(xì)胞數(shù)（LYMPH）、單核細(xì)胞數(shù)（MONO）、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)（EO）、嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）、中性粒細(xì)胞百分率（NEUT%）、淋巴細(xì)胞百分率（LYMPH%）、單核細(xì)胞百分率（MONO%）、嗜酸性細(xì)胞百分率（EO%）、嗜堿性細(xì)胞百分率（BASO%）。

1.3.2 血清生化指標(biāo)、脂肪代謝指標(biāo)和微量元素 使用普朗SMT100儀器檢測(cè)梅山豬血生化、脂肪代謝、微量元素指標(biāo)，包括：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、血清白/球蛋白（A/G）、谷氨酪轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、血糖（GLU）、尿素氮（Urea）、肌酐（Crea）、鈣（Ca）、磷（P）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、鉀（K）、鈉（Na）、血清氯（Cl）、血清膽堿酯酶（CHE）。

1.3.3 免疫指標(biāo) 購買ELISA試劑盒檢測(cè)梅山豬免疫調(diào)節(jié)因子指標(biāo)IL-2、IL-4、IL-8；檢測(cè)天然免疫因子IFN-γ和TNF-α；檢測(cè)蛋白抗體IgA、IgG、IgM；補(bǔ)體因子C3、C4。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有圖表數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0和Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用Mean±SE表示，并對(duì)數(shù)據(jù)做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅山豬氣喘病的血液常規(guī)指標(biāo)

由表1可知，血液常規(guī)指標(biāo)方面，相對(duì)于參考值，氣喘病組的試驗(yàn)豬血液常規(guī)指標(biāo)部分出現(xiàn)異常，具體為氣喘病組的試驗(yàn)豬血液WBC、NEUT、NEUT%、LYMPH和LYMPH%大于參考范圍最大值，而HCT、PDW小于參考范圍最小值；正常組均值均在參考范圍值之內(nèi)，但統(tǒng)計(jì)分析時(shí)也有個(gè)體個(gè)別指標(biāo)在參考范圍外。兩組試驗(yàn)豬之間WBC、P-LCR、NEUT、NEUT%、 RDW-SD和LYMP這6項(xiàng)指標(biāo)有極顯著差異（P＜0.01），HCT 、MONO和LYMPH%這3項(xiàng)指標(biāo)有顯著差異（P＜0.05），其他指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05）。

表1 兩組梅山豬氣喘病的血液常規(guī)指標(biāo)

2.2 梅山豬的血清生化指標(biāo)、脂肪代謝指標(biāo)和微量元素

2.2.1 梅山豬的血清生化指標(biāo) 由表2可知，血清生化指標(biāo)方面，相對(duì)于參考值，兩組都有相關(guān)指標(biāo)出現(xiàn)異常。其中，氣喘病組梅山豬的血清ALT、AST、ALP、Urea和CK這5項(xiàng)指標(biāo)大于參考范圍最大值，正常組梅山豬的血清中AST、ALP這2項(xiàng)指標(biāo)大于參考范圍最大值。兩組試驗(yàn)豬在ALT、ALP、Urea這3項(xiàng)指標(biāo)上有極顯著差異（P＜0.01），AST有顯著差異（P＜0.05）。

表2 兩組梅山豬氣喘病的血清生化指標(biāo)

2.2.2 梅山豬的血清脂肪代謝指標(biāo) 由圖1可知，梅山豬氣喘病的血清脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)中，兩組試驗(yàn)豬在LDH指標(biāo)有顯著差異（P＜0.05），GLU、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C和CHE這些指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 兩組梅山豬氣喘病的血清脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)

2.2.3 梅山豬的血清微量元素 由圖2可知，兩組試驗(yàn)豬在微量元素相關(guān)指標(biāo)方面均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 兩組梅山豬氣喘病的血清微量元素相關(guān)指標(biāo)

2.3 梅山豬的血清免疫指標(biāo)

從梅山豬氣喘病血清免疫指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果我們可以看出（圖3），兩組試驗(yàn)豬在IgA 、IgG2項(xiàng)指標(biāo)上有極顯著差異（P＜0.01），在IL-2和IFN-γ這2項(xiàng)指標(biāo)上有顯著差異（P＜0.05），其他指標(biāo)無顯著（P＞0.05）差異。

圖3 兩組梅山豬氣喘病的免疫指標(biāo)

3 討論

3.1 梅山豬的血常規(guī)指標(biāo)分析

在血常規(guī)指標(biāo)中，白細(xì)胞分為5類：淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞。它們是機(jī)體內(nèi)與細(xì)菌、病毒、支原體等戰(zhàn)斗的“警察部隊(duì)”，每種白細(xì)胞具體對(duì)抗的病原體也不一樣，其中淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)對(duì)抗支原體。正常情況下，機(jī)體血液中免疫指標(biāo)如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等都處于一個(gè)范圍內(nèi)波動(dòng)不變，這是機(jī)體免疫功能正常的表現(xiàn)［4-5］。但是，當(dāng)機(jī)體自身發(fā)生疾病或者遭受病原微生物侵染時(shí)，自身的免疫系統(tǒng)就會(huì)針對(duì)性地建立防御系統(tǒng)，自身免疫系統(tǒng)的強(qiáng)弱對(duì)機(jī)體的恢復(fù)起決定性作用［6］。另外，由于地方豬在控制淋巴細(xì)胞亞類上有其獨(dú)特的遺傳特征，這使得地方豬沒有明顯的免疫缺陷而有較高的抵抗力［7］。動(dòng)物機(jī)體的血常規(guī)指標(biāo)是最直接反映動(dòng)物健康狀態(tài)的指標(biāo)，本研究中的氣喘病組梅山豬血常規(guī)指標(biāo)中的WBC、LYMPH指標(biāo)超過參考范圍值最大值，也顯著高于正常組（P＜0.05），說明氣喘病組的梅山豬中存在疾病，而且是病毒或者支原體，機(jī)體對(duì)病原產(chǎn)生抵抗。正常組梅山豬也有個(gè)別指標(biāo)超出參考范圍最大值，這可能是因?yàn)閭€(gè)別豬也處于亞健康或者疾病狀態(tài)，但無明顯癥狀。當(dāng)然，如果是不同品種間，也可能會(huì)出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），這是因?yàn)閯?dòng)物不同品種間控制各項(xiàng)指標(biāo)的基因座也有顯著差異［8］，但本試驗(yàn)的豬均為同一個(gè)品種，因而排除這種可能，只能是疾病的因素。2018年，陳少康等［9］研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞可以作為診斷豬群是否即將感染或已經(jīng)處于感染初期的一個(gè)輔助指標(biāo)。本研究中，氣喘病組梅山豬的NEUT、NEUT%指標(biāo)超出其參考值范圍最大值，且兩組梅山豬之間存在極顯著差異（P＜0.01），進(jìn)一步驗(yàn)證了氣喘病組的梅山豬群體處于疾病狀態(tài)。P-LCR、RDW-SD這2項(xiàng)指標(biāo)值高于參考值范圍最大值，其原因可能是動(dòng)物機(jī)體存在炎癥［10］。本研究中，兩組梅山豬血液中的P-LCR、RDW-SD這2項(xiàng)指標(biāo)均在參考值范圍內(nèi)，說明了兩組梅山豬機(jī)體內(nèi)還未發(fā)生炎癥，但氣喘病組的梅山豬群體極顯著（P＜0.01）高于正常組的梅山豬群體，氣喘病組梅山豬群體可能即將出現(xiàn)炎癥。HGB、MCH和MCHV等指標(biāo)均在參考值范圍內(nèi)，兩組也無顯著差異（P＞0.05），說明總的運(yùn)氧能力還是處于正常狀態(tài)，兩組梅山豬無顯著差異（P＞0.05），氣喘病組梅山豬短期無重危癥狀。從梅山豬的血常規(guī)指標(biāo)上來看，基本還是能反映出兩組梅山豬的健康狀況，從而進(jìn)一步為我們篩選抗氣喘病梅山豬提供數(shù)據(jù)參考。

3.2 梅山豬的血清生化指標(biāo)、脂肪代謝指標(biāo)和微量元素分析

肝臟是動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化和代謝的主要場(chǎng)所，動(dòng)物血清中的生化指標(biāo)是判斷動(dòng)物機(jī)體是否受損傷的重要依據(jù)。ALT和AST主要存在動(dòng)物機(jī)體的肝細(xì)胞的胞漿和線粒體中，這2項(xiàng)指標(biāo)直接反映了肝細(xì)胞或線粒體的受損狀態(tài)［11］。ALT還是肝臟參與氨基酸代謝中活性最高的轉(zhuǎn)氨基活性酶，當(dāng)肝臟受損時(shí)會(huì)有大量的ALT進(jìn)入血清［12］。本研究中，氣喘病組梅山豬ALT異常，且與正常組梅山豬有極顯著差異，說明氣喘病組梅山豬肝臟已經(jīng)受損；但在AST指標(biāo)方面，兩組試驗(yàn)豬都表現(xiàn)異常，且差異極顯著，這可能和品種有關(guān)，或者是因?yàn)檎＝M的梅山豬有個(gè)體是肝臟受損的。ALP是一種廣泛存在于機(jī)體肝臟、骨骼、腎臟等各組織中的酶［13］，不是單一的酶，是一組同工酶，這種酶能催化核酸分子脫掉5′磷酸基團(tuán)，從而使得DNA或者RNA片段的5′-P末端換成5′-OH末端。本研究中的兩組試驗(yàn)豬ALP都出現(xiàn)異常，兩組間也出現(xiàn)極顯著差異，這可能是由于梅山豬在骨骼方面都存在或多或少的疾病而導(dǎo)致的，氣喘病組梅山豬群體由于氣喘病導(dǎo)致骨骼疾病更加明顯，使得堿性磷酸酶異常。TP、GLOB、ALB、A/G等指標(biāo)和蛋白質(zhì)的代謝有關(guān)，血清中ALB的含量越高，A/G 值越大就越有利于蛋白質(zhì)的沉積［14］。血清中CHOL、TG含量是衡量動(dòng)物體內(nèi)脂肪代謝，能反映出血栓形成、擴(kuò)張血管等的重要指標(biāo)［15］。CHOL是反映血液血脂方面的指標(biāo)，2015年劉科等［16］對(duì)融水小型豬F1代血的生化指標(biāo)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，CHOL是反映血脂和肥胖的一種重要指標(biāo)。本研究中梅山豬是地方品種豬，飼養(yǎng)時(shí)間長，肥胖，完全有可能導(dǎo)致血清中的膽固醇含量超標(biāo)，兩組試驗(yàn)豬的CHOL含量均超過參考值范圍，但無顯著差異（P＞0.05）。兩組GLU均偏高，但無顯著差異，這可能是由于梅山豬的品種問題，膽小應(yīng)激反應(yīng)大，采血應(yīng)激引起。Urea是反映腎功能的指標(biāo)，氣喘病組梅山豬Urea指標(biāo)異常，且兩組存在極顯著差異（P＜0.01），說明氣喘病組梅山豬的腎系統(tǒng)功能已經(jīng)開始受到影響了。CK、LDH這2個(gè)指標(biāo)是反映心機(jī)功能指標(biāo)［17］，本研究中兩組試驗(yàn)豬這2個(gè)指標(biāo)都超出參考范圍最大值，兩組的LDH指標(biāo)差異顯著（P＜0.05），分析原因可能是梅山豬缺乏運(yùn)動(dòng)，偶爾運(yùn)動(dòng)或者應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致心機(jī)功能異常，同時(shí)，由于氣喘病組梅山豬的氣喘病，心臟加速跳動(dòng)給機(jī)體其他的器官運(yùn)輸血氧，LDH指標(biāo)和正常組的出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。另外，在試驗(yàn)研究中，Ca、P、Na、K、Cl等微量元素指標(biāo)兩組試驗(yàn)豬都正常，也沒有顯著差異（P＞0.05），表明兩組試驗(yàn)豬生長發(fā)育正常，不存在營養(yǎng)方面的問題。

3.3 梅山豬的血清免疫指標(biāo)分析

免疫指標(biāo)是反映動(dòng)物機(jī)體健康狀態(tài)的重要指標(biāo)，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)血清中的抗體含量是動(dòng)物健康與否的重要反映，機(jī)體內(nèi)免疫因子的差異可以說明其表達(dá)分泌的分子通路存在差異［18］。IL-2、IL-4和IL-8是免疫因子，其差異是動(dòng)物群體免疫力強(qiáng)弱的決定因素，類似的指標(biāo)還有IFN-γ和TNF-α［19］。動(dòng)物血液組織液等分泌液中存在一類具有抗體活性的球蛋白，這就是免疫球蛋白，免疫球蛋白有5種：IgA、IgG、IgD、IgE、IgM［20］。IgA能夠抗病毒、中和毒素和其他抗原，具有廣泛的免疫保護(hù)作用，是機(jī)體參與黏膜反應(yīng)的主要效應(yīng)因子［21］；IgM 是機(jī)體感染初期最早產(chǎn)生的抗體，在機(jī)體抗感染早期有著非常重要的作用［22］；IgG 主要是通過體液免疫阻止病原體抗原穿透過黏膜而進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體組織致?。?3］。所以本研究中主要檢測(cè)IgA、IgG、IgM這3個(gè)抗體指標(biāo)，來說明試驗(yàn)豬的抗病能力。補(bǔ)體（Complement， C） ，約占血清球蛋白總量的10%，是一類具有酶活性的動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的免疫球蛋白［24］，機(jī)體首先要激活C3，后續(xù)才能連續(xù)激活其他補(bǔ)體；C4是當(dāng)機(jī)體防御外源病菌侵入時(shí)通過免疫符合作用清除病原微生物［25］。本研究中，氣喘病組梅山豬的IgA、IgG這2項(xiàng)指標(biāo)均極顯著低于正常組，說明其抗體水平極顯著低于正常組，抵抗力相比正常組，嚴(yán)重下降。兩組試驗(yàn)豬的IgM之間差異不顯著（P＞0.05），說明氣喘病組梅山豬染病已有一段時(shí)間，不是染病初期階段。IL-2、IFN-γ這2項(xiàng)指標(biāo)方面，兩組試驗(yàn)豬之間出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），也說明氣喘病組梅山豬的免疫力比正常組梅山豬弱，這可能是由于肺炎支原體已經(jīng)侵入梅山豬機(jī)體內(nèi)。但是，兩組試驗(yàn)豬的補(bǔ)體水平?jīng)]有差異（P＞0.05），這點(diǎn)需要進(jìn)一步深入研究，繼續(xù)挖掘其內(nèi)在機(jī)制。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)梅山豬氣喘病的生理生化、免疫指標(biāo)檢測(cè)并分析發(fā)現(xiàn)，梅山豬氣喘病在血液常規(guī)指標(biāo)中的WBC、P-LCR、NEUT、NEUT%、RDWSD、LYMPH、HCT、MONO和LYMPH%，血清生化指標(biāo)中的ALT、ALP、Urea、AST，脂肪代謝指標(biāo)中的LDH以及免疫指標(biāo)中的IgA、IgG、IL-2和IFN- γ等指標(biāo)與正常梅山豬之間有極顯著或者顯著差異，篩選抗氣喘病梅山豬可以重點(diǎn)參考并篩查以上這些指標(biāo)相關(guān)的基因及其表達(dá)情況。