乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白1相互作用蛋白的篩選和驗(yàn)證①

林麗華 錢 鋒 吳秀珍 馬菲菲 黃紹娥 卓德祥

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬三明第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，三明 365000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。根據(jù)不同的臨床表現(xiàn)和分子表達(dá)譜改變，膀胱癌可以分為兩大類，非肌肉浸潤(rùn)性和肌肉浸潤(rùn)性，其中75%～80%是非肌肉侵襲性膀胱癌，復(fù)發(fā)率高達(dá)50%～70%［1］。目前臨床上主要采用根治性膀胱切除術(shù)、保留膀胱的經(jīng)尿道切除術(shù)、化學(xué)療法和放射療法治療膀胱癌，但轉(zhuǎn)移性膀胱癌的預(yù)后仍不理想。因此，有必要進(jìn)一步深入了解膀胱癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制，以期為膀胱癌的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

乙肝病毒全S蛋白反式激活蛋白1（complete S transactivated protein 1，CSTP1）是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白磷酸酶，其表達(dá)在膀胱癌組織中明顯降低。先前研究結(jié)果顯示，膀胱癌細(xì)胞中CSTP1過表達(dá)可以使Akt激酶第473位絲氨酸殘基去磷酸化而失活，導(dǎo)致下游Foxo3A轉(zhuǎn)錄因子活化，活化后的Foxo3A轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，結(jié)合至IL-6基因啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)［2-3］。

為進(jìn)一步了解CSTP1在腫瘤中的生物學(xué)功能，采用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選真核細(xì)胞中能與CSTP1相互結(jié)合的蛋白，從其可能的作用靶標(biāo)入手，探討其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料DNA聚合酶購(gòu)自Thermo Fisher公司；人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)、淋巴組織cDNA文庫(kù)、人胎肝cDNA文庫(kù)、人胎腦cDNA文庫(kù)、人腎cDNA文庫(kù)、人脾cDNA文庫(kù)、酵母雙雜交試劑盒、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海睿星基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 誘餌質(zhì)粒構(gòu)建PCR擴(kuò)增得到CSTP1基因編碼區(qū)片段，引物序列分別為F：5'-TGACTGTATCGCCGGCCAATCCGGCCATGTCGGCTGCAGAGGCGGGGGGTGTTT-3'；R：5'-GCGGCCGCTGCAGGGCCTCTAAGGCCTCATTTTTTCTTGATCAAATCCATG-3'。PCR產(chǎn)物膠回收酶切后連接入pGBKT7空載體得到誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CSTP1。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-CSTP1、pcDNA3.1-HA-RanBP9和pcDNA3.1-HA-PSMD7由湖南豐暉生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2.2 誘餌質(zhì)粒毒性檢測(cè)將pGBKT7-CSTP1和pGBKT7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化Y2HGold菌，涂布SD/-Trp平板，觀察酵母菌落生長(zhǎng)情況；4 d后挑取菌落接種至5 ml SD/-Trp液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，分光光度計(jì)檢測(cè)OD600值，每5 h檢測(cè)1次，共進(jìn)行6次檢測(cè)。

1.2.3 誘餌質(zhì)粒自激活檢測(cè)將pGBKT7-CSTP1誘餌質(zhì)粒 和pGADT7（AD空載體）轉(zhuǎn)化Y2HGold菌，涂 布SD/-leu-Trp和SD/-leu-Trp-his-ade+ABA+X-a-gal平板，30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)；同時(shí)設(shè)pGBKT7-53和pGADT7-T為 陽(yáng)性對(duì)照組，pGBKT7-Lam和PGADT7-T為陰性對(duì)照組，并將菌液涂布SD/-leu-Trp和SD/-leu-Trp-his-ade+ABA+X-a-gal平板，30℃倒置培養(yǎng)。

1.2.4 酵母雙雜交挑取5個(gè)Y2HGold酵母菌（pGBKT7-CSTP1）于1 ml SD/-Trp液體培養(yǎng)基，混勻后轉(zhuǎn)入150 ml SD/-Trp培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)至OD600=1.2（約20 h），將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入YPDA中混勻，振蕩培養(yǎng)5 h，低速離心收集菌體。離心收集的菌液用500 ml雙蒸水洗滌1次，低速離心收集菌體。30 ml 1×TE/LiAC洗滌菌體，低速離心收集菌體。1×TE/LiAc重懸菌體，加入350μg混合cDNA文庫(kù)質(zhì)粒和已經(jīng)預(yù)變性的Carrier DNA，輕輕混勻。加1×TE/LiAc/PEG，劇烈渦旋混勻。30℃，45 min，每15 min混勻1次。加DMSO，輕輕混勻。42℃熱激20 min，每10 min混勻1次。冰浴5 min后低速離心收集菌體。加入1 000 ml YPDA，30℃振蕩培養(yǎng)60 min，低速離心收集菌體。加入3 ml 0.9%NaCl重懸菌體。將菌液涂布于15 cm SD/-leu-Trp-his-ade+ABA+X-a-gal平板上（200μl/塊）。第5天起觀察菌落生長(zhǎng)。

1.2.5 陽(yáng)性克隆驗(yàn)證挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)菌抽提酵母質(zhì)粒（含誘餌質(zhì)粒和獵物質(zhì)粒），轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，涂布含氨芐青霉素的LB板，陽(yáng)性克隆用LB液體培養(yǎng)基（Ampr）擴(kuò)菌，提取質(zhì)粒，部分用于測(cè)序，部分與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化Y190酵母菌，菌液涂布SD/-Trp/-Leu平板，同時(shí) 設(shè) 置PGBKT7-53和pGADT7-T共轉(zhuǎn)為陽(yáng)性對(duì)照及pGBKT7-Lam和pGADT7-T共轉(zhuǎn)為陰性對(duì)照。30℃培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)至2 mm后進(jìn)行β-半乳糖苷酶顯色實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 免疫共沉淀CSTP1、RanBP9和PSMD7基因開放閱讀區(qū)克隆真核表達(dá)質(zhì)粒載體，得到pcDNA3.1-CSTP1(3×Flag標(biāo) 簽)、pcDNA3.1-RanBP9（HA標(biāo)簽）和pcDNA3.1-PSMD7（HA標(biāo)簽）表達(dá)質(zhì)粒。將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-3×Flag-CSTP1分別和pcDNA3.1-HA-RanBP9或pcDNA3.1-HA-PSMD7共轉(zhuǎn)膀胱癌EJ和RT4細(xì)胞；24 h后收集細(xì)胞于1.5 ml離心管，加預(yù)冷RIPA裂解液，冰上靜置裂解15 min；4℃，14 000 r/min離心15 min；留取30μl細(xì)胞裂解液作陽(yáng)性對(duì)照，轉(zhuǎn)移其余上清到新的離心管；加沉淀抗體到上清液中，4℃緩慢搖動(dòng)過夜；加Protein A瓊脂糖珠，4℃緩慢搖動(dòng)過夜；14 000 r/min離心5 s后收集沉淀物，用預(yù)冷磷酸緩沖液清洗3次，2×上樣緩沖液將重懸沉淀物，煮沸變性5 min；anti-HA抗體蛋白印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建誘餌質(zhì)粒用特異性引物從混合文庫(kù)中擴(kuò)增目的基因編碼區(qū)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳鑒定（圖1A），膠回收后克隆入空載體pGBKT7。挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定（圖1B）和測(cè)序分析，3個(gè)克隆測(cè)序全部測(cè)通，在核苷酸722 bp位置均有1個(gè)相同的有義突變，核酸A-G，氨基酸lys-arg，判斷為物種本來(lái)的原始序列，成功將CSTP1裝入酵母表達(dá)載體中，可以進(jìn)行下游蛋白質(zhì)篩選實(shí)驗(yàn)。

圖1 誘餌質(zhì)粒構(gòu)建Fig.1 Construction of bait plasmids

2.2 誘餌質(zhì)粒毒性檢測(cè)將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CSTP1與pGBKT7轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母菌，涂布SD/-Trp平板，觀察酵母菌生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)化pGBKT7質(zhì)粒的酵母菌相比，表達(dá)誘餌蛋白的酵母生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量和大小基本一致。5 d后挑取單克隆酵母菌落接種至SD/-Trp液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，分光光度計(jì)每6 h檢測(cè)OD600nm值，含誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CSTP1的酵母與含空載體的對(duì)照酵母生長(zhǎng)無(wú)顯著差別（圖2）。結(jié)果表明誘餌質(zhì)粒表達(dá)的蛋白對(duì)酵母菌沒有毒性。

圖2 轉(zhuǎn)染了誘餌質(zhì)粒和空載體的酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線圖Fig.2 Growth curves of yeast transformed with bait plasmids and empty vectors respectively

2.3 誘餌質(zhì)粒自激活檢測(cè)為檢測(cè)誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CSTP1在酵母菌內(nèi)是否具有自激活活性，將pGBKT7-CSTP1質(zhì)粒和pGADT7空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母菌，轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂布平板，觀察菌落在選擇性固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。如圖3所示，陽(yáng)性對(duì)照的酵母菌落在SD/-leu-Trp和SD/-leu-Trp-his-ade+ABA+X-a-gal兩種培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，但在后者培養(yǎng)基上菌落顏色變藍(lán)；陰性對(duì)照在SD/-leu-Trp培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)，但在后者培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)；含有誘餌蛋白的酵母能在SD/-leu-Trp培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而無(wú)法在SD/-leu-Trp-his-ade+ABA+X-a-gal培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，提示基因PGB-CSTP1轉(zhuǎn)入Y2HGold酵母菌后不能自激活酵母細(xì)胞攜帶的報(bào)告基因，該蛋白不存在自激活現(xiàn)象，可以進(jìn)行下游篩選實(shí)驗(yàn)。

圖3 誘餌質(zhì)粒自激活檢測(cè)Fig.3 Autoactivation detection of bait plasmids

2.4 酵母雙雜交及陽(yáng)性克隆測(cè)序分析 為篩選CSTP1相互作用蛋白，將6個(gè)人cDNA混合文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)誘餌蛋白的Y2HGold宿主菌，轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂布于選擇性培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)情況。如圖4，固體培養(yǎng)基上有7個(gè)酵母克隆生長(zhǎng)，從7個(gè)陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌后涂布LB（ampr）平板，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增細(xì)菌質(zhì)粒用于測(cè)序，得到2個(gè)宿主蛋白，分別是RAN結(jié)合蛋白9（RAN binding protein 9，RANBP9）及蛋白酶體26S非ATP酶調(diào)節(jié)亞基7（proteasome 26S subunit，non-ATPase 7，PSMD7）。

圖4 酵母雙雜交篩選CSTP1相互作用蛋白Fig.4 Screening of proteins interacting with CSTP1 by yeast two-hybrid assay

2.5 酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證蛋白相互作用為驗(yàn)證2種獵物質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白和CSTP1在酵母菌中相互作用，將獵物質(zhì)粒pGADT7-RANBP9和pGADT7-PSMD7分別和誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CSTP1共轉(zhuǎn)化酵母菌Y190。菌落β-半乳糖苷酶顯色實(shí)驗(yàn)顯示，陰性對(duì)照組β-半乳糖苷酶顯色實(shí)驗(yàn)不顯色，而陽(yáng)性對(duì)照組β-半乳糖苷酶顯色實(shí)驗(yàn)顯藍(lán)色，同時(shí)pGADT7-RANBP9和pGADT7-PSMD7實(shí)驗(yàn)組分別在1 h和3 h內(nèi)快速顯示藍(lán)色（圖5），結(jié)果提示，誘餌蛋白CSTP1和獵物蛋白R(shí)ANBP9、PSMD7在Y190酵母菌中能夠發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，激活酵母菌Y190 LacZ報(bào)告基因。

圖5 共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證誘餌蛋白和獵物蛋白相互作用Fig.5 Co-transformation of bait and prey plasmids to verify protein interaction

2.6 膀胱癌細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證蛋白相互作用將pcDNA3.1-CSTP1質(zhì)粒分別和pcDNA3.1-RanBP9或pcDNA3.1-PSMD7質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染膀胱癌EJ細(xì)胞和RT4細(xì)胞，免疫共沉淀檢測(cè)CSTP1是否和RanBP9或PSMD7蛋白相互作用。如圖6結(jié)果顯示，在用Flag抗體共沉淀得到的復(fù)合物中能檢測(cè)到攜帶HA標(biāo)簽的RanBP9和PSMD7蛋白。

圖6 免疫共沉淀CSTP1和RanBP9或PSMD7Fig.6 Coimmunoprecipitation between CSTP1 and Ran-BP9 or PSMD7

3 討論

蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活性調(diào)節(jié)機(jī)制之一，廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)500多種蛋白激酶，如Akt、Ras、BRAF、PIM-1等，并且對(duì)其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用已經(jīng)有較深入的研究，但關(guān)于蛋白磷酸酶的研究則相對(duì)較少［4-7］。研究顯示，蛋白磷酸酶往往具有腫瘤抑制基因的特性，如PTEN，PP2A等［8-9］。先前研究結(jié)果證實(shí)CSTP1是一新的蛋白磷酸酶，并發(fā)現(xiàn)Akt激酶是其下游底物之一，為進(jìn)一步探討CSTP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本研究采用酵母雙雜交方法篩選并驗(yàn)證與CSTP1相互作用的蛋白，以期通過與其相互作用蛋白的功能線索來(lái)深入研究CSTP1的功能。

本研究中，首先在人正常組織cDNA文庫(kù)中用PCR方法調(diào)取CSTP1基因序列，測(cè)序發(fā)現(xiàn)3個(gè)克隆在核苷酸722 bp位置均存在相同的一個(gè)有義突變，腺嘌呤（A）突變成鳥嘌呤（G），最終導(dǎo)致編碼的氨基酸從賴氨酸突變成精氨酸，判斷為物種本來(lái)的原始序列。以調(diào)取的CSTP1基因序列構(gòu)建pGBKT7-CSTP1誘餌質(zhì)粒，細(xì)胞生長(zhǎng)毒性試驗(yàn)和自激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)不存在毒性，且誘餌質(zhì)粒本身不能自激活酵母細(xì)胞攜帶的報(bào)告基因，說(shuō)明CSTP1蛋白不存在自激活現(xiàn)象。用轉(zhuǎn)化法酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選人白細(xì)胞、淋巴組織、人胎肝、人胎腦、人腎組織、人脾組織cDNA混合文庫(kù)，得到7個(gè)陽(yáng)性酵母克隆，經(jīng)測(cè)序分析得到2條基因序列分別為RANBP9和PSMD7。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)CSTP1能和RANBP9或PSMD7相互作用。

RANBP9最初是作為RAN的結(jié)合蛋白而發(fā)現(xiàn)的，參與微管成核現(xiàn)象，并因此而命名為RANBPM［10］。研究表明RANBP9參與結(jié)直腸癌、胃癌、骨肉瘤、肺癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，但其具體的分子機(jī)制尚未明確［11-16］。PSMD7是JAMM家族的去泛素化酶，位于19S蛋白酶體蓋子亞復(fù)合體的核心部位［17］。PSMD7是否參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展目前尚不清楚，但已有報(bào)道其在食管鱗癌細(xì)胞EC9706和Eca109中呈高表達(dá)，并且敲除PSMD7表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示其可能參與了食管癌的發(fā)生、發(fā)展［18］。綜上，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選并鑒定2個(gè)CSTP1相互作用蛋白，分別是RANBP9和PSMD7，為研究CSTP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了下一步的研究思路。