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    lncRNA NEAT1促進(jìn)宮頸癌發(fā)展的作用及機(jī)制研究

    2022-11-15 09:03:04李怡琳梅郭曉霞江廖治
    中國免疫學(xué)雜志 2022年17期
    關(guān)鍵詞:宮頸癌宮頸實驗組

    李怡琳梅 劼 郭曉霞 雷 華 江廖治 凌 波 江 虹②

    (四川省人民醫(yī)院,電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院,成都 610000)

    宮頸癌包括宮頸鱗癌和宮頸腺癌,是一種宮頸上皮細(xì)胞惡性增殖導(dǎo)致的婦科惡性腫瘤,發(fā)病率逐年升高,手術(shù)切除或放化療后極易再次復(fù)發(fā),預(yù)后不佳,成為嚴(yán)重困擾女性健康的社會公共問題之一[1]。雖然宮頸癌的篩查以及疫苗預(yù)防等方面有了較為明顯的進(jìn)展,但具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,尚未出現(xiàn)針對該病的根治性治療措施,因此深入揭示疾病的分子機(jī)制,尋找宮頸癌特有的分子標(biāo)志物,為患者開展基因靶向治療成為目前宮頸癌研究的熱點之一[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度大于200 bp具有種屬特異性的非編碼RNA。近來研究顯示lncRNA通過干預(yù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá),在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌的作用[3]。近來長鏈非編碼核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(long non-coding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1,lncRNA NEAT1)在肺癌、胃癌等多種腫瘤中過表達(dá),且與腫瘤的增殖以及病情進(jìn)展密切相關(guān)引起廣泛關(guān)注[4]。CHEN等[5]研究顯示lncRNA NEAT1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá),并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力,推動腫瘤病情進(jìn)展。QUAN等[6]研究表明乳腺癌患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1的水平升高,可作為腫瘤預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。但有關(guān)lncRNA NEAT1在宮頸癌中的作用報道較少。本研究以宮頸癌組織和宮頸腫瘤細(xì)胞HeLa作為研究對象,研究lncRNA NEAT1在宮頸癌中的表達(dá)情況,揭示其對腫瘤細(xì)胞增殖的影響機(jī)制,為宮頸癌的靶基因治療提供新的思路。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 一般資料選取2018年3月至2020年3月在四川省人民醫(yī)院進(jìn)行外科切除病灶的宮頸癌患者50例,所有患者均為原發(fā)性宮頸癌患者,且經(jīng)病理驗證為首次確診者,年齡25~73,平均(30.53±8.67)歲,入選患者均未經(jīng)放化療、免疫或激素干預(yù),排除其他部位惡性腫瘤以及自身免疫性疾?。?]。另取同期50例因子宮平滑肌瘤(宮頸無任何病變)等良性疾病而切除子宮的正常宮頸組織作為對照,年齡22~76,平均(31.25±9.48)歲,本研究已獲得患者或家屬的知情同意書,且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.1.2 實驗動物、細(xì)胞及主要試劑人宮頸癌細(xì)胞HeLa購自美國菌種保藏中心(ATCC);沉默lnc-RNA NEAT1表 達(dá) 的lncRNA NEAT1-siRNA以 及 陰性對照(lncRNA NEAT1-siRNA-NC)由上海吉凱生物技術(shù)有限公司提供。兔抗大鼠磷酸化組蛋白(γ-H2AX)、毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白激酶(ataxia-telangiectasia mutated kinase,ATM)抗體(美國Jackson公司);CCK-8試劑盒、Western blot試劑盒(美國Invitrogen公司);蘇凈Airtech超凈工作臺(美國Thermo Fisher公司),BD-56集成式恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國BINDER公司);ⅨPlore Standard倒置顯微鏡(日本Olympus公司);凝膠自動成像系統(tǒng)(美國Sigma-Aldrich公司);實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 應(yīng)用在線生物數(shù)據(jù)庫檢索lncRNA NEAT1表達(dá)從GEO中提取GSE63514和GSE6791兩個宮頸癌芯片數(shù)據(jù),通過R軟件分析lncRNAs在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá),確定在兩個數(shù)據(jù)集中表達(dá)差異最為明顯的lncRNA;利用UALCAN分析lnc-RNA NEAT1表達(dá)對宮頸癌患者生存期的影響[8]。

    1.2.2 qRT-PCR進(jìn)行驗證使用Trizol試劑盒分別提取宮頸癌組織和正常宮頸組織中總的RNA,根據(jù)Prime ScripTM試劑要求逆轉(zhuǎn)錄生成反義cDNA,以此為模板采用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增(95℃5 s,單次循環(huán)后;95℃5 s;60℃60 s,采集熒 光 信號40個 循環(huán))[9];U6作為內(nèi)參(正向引物為5'-CTTCCAATACGTGCAGCAGA-3',反向引物為5'-CCCCAGAGACATGATGAAGTCA-3'),lncRNA NEAT1(正向引物為5'-CACCATGGGAGAAGGCCGGGG-3',反向引物為5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3'),各目的基因的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

    1.2.3 lncRNA NEAT1的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系提取入選患者的臨床病理資料,將lncRNA NEAT1的表達(dá)與患者的年齡、腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、組織學(xué)分級情況進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染以及分組處理將人HeLa細(xì)胞株復(fù)蘇后,接種于含有滅活的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設(shè)定條件:37℃,5%CO2,當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)85%時開始實驗。本研究中細(xì)胞實驗分為3組[10]:正常組、對照組、實驗組。正常組:不加任何藥物,常規(guī)培養(yǎng);對照組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染150 nmol/L的lncRNA NEAT1-siRNA-NC后,常規(guī)培養(yǎng);實驗組:細(xì)胞轉(zhuǎn)染150 nmol/L的lncRNA NEAT1-siRNA后,常規(guī)培養(yǎng)。

    1.2.5 CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,分組處理同上,輕輕混勻后,在恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后,每孔加入100μl的CCK-8試劑,孵育2 h,使用多功能酶標(biāo)儀測定OD450[11],每組連續(xù)測量4 d。

    1.2.6 DNA ladder分析各組細(xì)胞DNA的損傷情況將細(xì)胞調(diào)整3×105個/ml接種6孔板,分組處理同1.2.4,37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,添加細(xì)胞裂解液,留取上清,依次添加適量Tris液、RNA酶,在50 V下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,常溫染色,紫外燈下拍照,自動成像系統(tǒng)分析條帶的相對強(qiáng)度,以表示細(xì)胞DNA的損傷情況[12]。

    1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率調(diào)整細(xì)胞3×105個/ml接種6孔板,分組處理同1.2.4,37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,PBS緩沖液將各組細(xì)胞重懸,以70%乙醇固定,離心后,棄上清,加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色[13],PBS重懸,避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。

    調(diào)整細(xì)胞濃度3×105個/ml接種6孔板,分組處理同1.2.4,37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,PBS緩沖液將各組細(xì)胞重懸,滴加5μl的V-FITC和5μl的PI染色[14],避光孵育,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

    1.2.8 裸鼠皮下種植瘤模型檢測各組細(xì)胞的體內(nèi)生長調(diào)整細(xì)胞濃度,分組同1.2.4,以1×106個/孔接種后,在恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng),待生長密度達(dá)到1×107個/ml時,制成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行動物實驗。使用異氟烷將SD雌鼠麻醉,在裸鼠右前肢近胸腔處進(jìn)行消毒、備皮,使用100μl的注射器進(jìn)行皮下注射[15],4周后脫頸處死裸鼠,無菌剝離瘤體,稱重。

    1.2.9 Western blot檢測各組細(xì)胞中γ-H2AX、ATM蛋白表達(dá)水平胰酶消化細(xì)胞,離心稀釋成單細(xì)胞懸液,分組處理同1.2.4,按1×105個/孔接種至6孔板;置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱24 h,加入蛋白裂解液,分別提取各組細(xì)胞的總蛋白,測定濃度,置于沸水中變性,進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)膜,清洗后,在封閉液中孵育30 min,加入一抗(1∶500),孵育過夜,加入二抗(1∶1 000),二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色[16],以GAPDH作為內(nèi)參,Image J圖像分析軟件統(tǒng)計分析各條帶的灰度值。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析SPSS19.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以±s表示,采用t檢驗進(jìn)行分析;所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布檢驗,計數(shù)資料采用χ2檢驗分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 lncRNA NEAT1在宮頸癌中表達(dá)升高宮頸癌組織和正常組織間存在表達(dá)差異的lncRNA(圖1),進(jìn)一步采用維恩圖對兩基因芯片中的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的lncRNA進(jìn)行說明(圖2A),發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在兩芯片中的表達(dá)均明顯升高(圖2B、C);UALCAN分析顯示lncRNA NEAT1低表達(dá)患者的生存期優(yōu)于lncRNA NEAT1高表達(dá)患者(圖2D),說明在宮頸癌中l(wèi)ncRNA NEAT1的研究具有潛在臨床價值。

    圖1 宮頸癌組織和正常組織差異表達(dá)的lncRNAFig.1 Differentially expressed lncRNA in cervical cancer tissue and normal tissue

    圖2 lncRNA NEAT1表達(dá)Fig.2 Expression of lncRNA NEAT1

    2.2 qRT-PCR結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示,與正常宮頸組織(1.04±0.15)相比,lncRNA NEAT1在宮頸癌組織中的相對表達(dá)量(2.27±0.41)明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    圖3 lncRNA NEAT1表達(dá)Fig.3 Expression of lncRNA NEAT1

    2.3 lncRNA NEAT1表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,lncRNA NEAT1的相對表達(dá)與宮頸癌患者的腫瘤大小、組織學(xué)分級相關(guān)(均P<0.05),與患者的年齡、組織類型、TNM臨床分期、浸潤深度無關(guān)(P>0.05),見表1。

    表1 lncRNA NEAT1的相對表達(dá)與宮頸癌患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 Relationship between relative expression of lnc-RNA NEAT1 and clinicopathological parameters of cervical cancer patients

    2.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖CCK-8實驗結(jié)果顯示,從檢測第2天后,與正常組相比,實驗組細(xì)胞的OD450值明顯下降,增殖能力明顯下降(均P<0.05)。正常組與對照組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

    圖4 CCK-8實驗結(jié)果Fig.4 Experimental results of CCK-8

    2.5 DNA ladder分析各組細(xì)胞DNA的損傷情況瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,正常組和對照組細(xì)胞呈現(xiàn)一條較明顯的DNA大分子片段,實驗組細(xì)胞DNA出現(xiàn)3~4條200 bp、400 bp、800 bp、1 000 bp的區(qū)帶,即細(xì)胞凋亡獨有的“階梯圖譜”,說明實驗組細(xì)胞的DNA鏈斷裂嚴(yán)重,DNA損傷明顯,見圖5。

    圖5 DNA ladder分析實驗結(jié)果Fig.5 Experimental results of DNA ladder analysis

    2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與正常組相比,實驗組中處于G1期的細(xì)胞的比例明顯下降,處于S期細(xì)胞的比例明顯升高,形成S期阻滯,細(xì)胞凋亡率明顯升高(均P<0.05),正常組與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖6、圖7。

    圖6 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期Fig.6 Cell cycle of Cells in each group

    圖7 各組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡Fig.7 Cell apoptosis of each group

    2.7 皮下種植瘤結(jié)果比較 皮下種植瘤實驗結(jié)果如圖8所示,與正常組相比,4周后,實驗組裸鼠內(nèi)移植瘤明顯變小,瘤體重量明顯降低(P<0.05),正常組與對照組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    圖8 皮下種植瘤實驗結(jié)果Fig.8 Experimental results of subcutaneous tumor implantation

    2.8 Western blot檢測各組細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,實驗組細(xì)胞γ-H2AX、ATM蛋白表達(dá)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),正常組與對照組,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖9。

    圖9 Western blot結(jié)果Fig.9 Results of Western blot

    3 討論

    隨著宮頸細(xì)胞學(xué)與病毒學(xué)的進(jìn)步,宮頸癌的早期篩查率有了較為明顯的突破,在一定程度減輕了對女性群體的威脅。但技術(shù)仍有地區(qū)并未開展宮頸癌篩查或篩查項目嚴(yán)重不足,導(dǎo)致宮頸癌仍是困擾發(fā)展中地區(qū)和國家女性健康的癌癥類型之一[17]。手術(shù)與放化療是宮頸癌的主要治療措施,但由于腫瘤細(xì)胞旺盛的生命力,腫瘤復(fù)發(fā)率不斷攀升,患者預(yù)后不佳,因此基因靶向治療成為提高患者生命質(zhì)量的最有前景的治療方案之一[18]。目前眾多研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制,開展多方面的實驗,積極尋找癌細(xì)胞惡性增殖的分子標(biāo)志物。

    lncRNA NEAT1又被稱為HSALNG0000014,定位在染色體11q13.1。研究顯示作為細(xì)胞旁斑結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成部分,lncRNA NEAT1在維系腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白-mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用[19]。深入研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)的lncRNA NEAT1明顯增強(qiáng)癌細(xì)胞的生長與增殖能力,加快腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤及患者的病情進(jìn)展[20]。CHEN等[5]研究顯示,在非小細(xì)胞癌中,抑制lncRNA NEAT1的表達(dá)能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長與侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。LI等[21]研究表明沉默lncRNA NEAT1的表達(dá)能明顯降低乳腺癌細(xì)胞在小鼠成瘤模型中的體內(nèi)生長。WANG等[22]研究表明結(jié)腸癌患者血清中l(wèi)ncRNA NEAT1明顯升高,也是患者預(yù)后不良的獨立評價因子。本研究從LncExpDB數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在宮頸癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。對GEO數(shù)據(jù)庫GSE6791和GSE63514宮頸癌患者芯片的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在兩組數(shù)據(jù)集中的表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步對本研究收集的宮頸癌組織標(biāo)本研究發(fā)現(xiàn),lncRNA NEAT1的表達(dá)升高,并且lncRNA NEAT1的表達(dá)與患者腫瘤大小以及組織學(xué)分級相關(guān),說明lncRNA NEAT1的表達(dá)與宮頸癌的病情進(jìn)展關(guān)系密切。沉默其表達(dá)后,HeLa細(xì)胞的DNA損傷明顯,細(xì)胞的有絲分裂被阻滯在S期,體外增殖與體內(nèi)生長明顯受限,細(xì)胞的凋亡率明顯升高。

    細(xì)胞的DNA為雙鏈閉環(huán)超螺旋結(jié)構(gòu),是遺傳物質(zhì)的載體。其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的基礎(chǔ)[23]。DNA損傷是指細(xì)胞有絲分裂過程中DNA較為穩(wěn)定的核苷酸序列出現(xiàn)永久性的改變,進(jìn)而影響染色體復(fù)制以及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯。DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受損是導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂進(jìn)而使細(xì)胞趨于凋亡的主要原因。γ-H2AX、ATM蛋白是DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受損的生物標(biāo)志物[24]。TAIANA等[25]研究報道在多發(fā)性骨髓瘤中l(wèi)ncRNA NEAT1維系DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,并幫助腫瘤細(xì)胞進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。本研究表明沉默lncRNA NEAT1的表達(dá)后,HeLa的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)受損明顯,有序的細(xì)胞分裂阻滯在S期,細(xì)胞凋亡率升高。說明沉默lncRNA NEAT1有望成為潛在的宮頸癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)抑制劑,給宮頸癌的靶向治療帶來新的靶點。

    綜上,在宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達(dá)明顯升高,沉默其表達(dá)后,宮頸癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞的DNA損傷明顯,細(xì)胞周期被阻滯在S期,體外增殖與體內(nèi)生長明顯受限,細(xì)胞的凋亡率明顯升高。但是開展lncRNA NEAT1靶向治療宮頸癌仍需大樣本以及多維度的系統(tǒng)研究。

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