circ_0046263靶向miR-1184調(diào)控肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

劉文東 張嘉麟 余紫丹（惠州市第三人民醫(yī)院腫瘤科，惠州 516001）

肝細胞癌是全球癌癥病死率較高的腫瘤，多數(shù)患者確診時已是晚期，預(yù)后較差，肝癌監(jiān)測和早期發(fā)現(xiàn)增加了治愈的機會；分子靶向療法已在臨床上用于多種癌癥治療，研究導(dǎo)致肝癌發(fā)展和進展的各種分子機制，篩選特異性靶點、開發(fā)更多靶向特定途徑的藥物對肝癌診斷及治療具有重要意義［1-2］。環(huán)狀RNA（circRNA）是真核生物中具有特異性的共價封閉內(nèi)源性生物分子，可通過充當microRNA或蛋白抑制劑在多種疾病中發(fā)揮重要生物學(xué)功能，可作為多種類型癌癥的診斷或治療靶標［3-4］。研究報道，circ_0046263在鼻咽癌細胞系和組織中均表達上調(diào)；敲除circ_0046263可抑制鼻咽癌細胞增殖、侵襲和遷移［5］。circ_0046263在非小細胞肺癌中明顯上調(diào)；敲除circ_0046263對非小細胞肺癌細胞增殖、細胞周期和轉(zhuǎn)移具有抑制作用［6］。但circ_0046263在肝癌細胞中的作用及機制尚不清楚。本研究通過在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circ_0046263與miR-1184存在結(jié)合位點。研究報道，miR-1184在結(jié)腸癌細胞和組織中表達顯著下調(diào)；miR-1184過表達通過抑制Ki67表達抑制結(jié)腸癌細胞增殖，并通過上調(diào)cleaved caspase-3和 下調(diào)Bcl-2表達促進 其凋亡［7］。沉默circVANGL1通過上調(diào)miR-1184表達抑制膀胱癌細胞侵襲、遷移和增殖［8］。說明miR-1184可能在癌癥中起抑癌作用。但miR-1184在肝癌中的作用及circ_0046263是否調(diào)控miR-1184表達尚不清楚。因此，本實驗以肝癌細胞株HCCLM3為研究對象，探究circ_0046263是否影響肝癌細胞增殖、遷移和侵襲及其機制是否與miR-1184有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源選取惠州市第三人民醫(yī)院2017年1月至2020年12月經(jīng)病理檢測為肝癌且具有完整臨床病理資料的患者47例，其中男29例，女18例，年齡42～78歲，平均（56.7±2.1）歲。手術(shù)切除其腫瘤組織及癌旁組織，距腫瘤組織邊緣5 cm處切除的為癌旁組織，所有患者術(shù)前均未接受過任何放化治療或免疫治療，且知情同意。

1.1.2 主要試劑肝癌細胞株HCCLM3購自美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自廈門慧嘉生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁研究所；吉姆薩染色液購自廣州達暉生物技術(shù)股份有限公司；Transwell小室、Matrigel購自美國Corning公司；RIPA蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海臻諾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組肝癌細胞株HCCLM3采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，2 d換液1次，細胞融合至90%左右時消化傳代，取對數(shù)生長期細胞，轉(zhuǎn)染si-NC、si-circ_0046863、miR-NC、miR-1184，6 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，記為si-NC組、si-circ_0046863組、miR-NC組、miR-1184組；將si-circ_0046263分別與anti-miR-NC、anti-miR-1184共轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞，記為si-circ_0046263+anti-miR-NC組、si-circ_0046263+anti-miR-1184組。

1.2.2 RT-qPCR檢 測circ_0046263和miR-1184表達取適量肝癌組織、癌旁組織，加入Trizol試劑提取總RNA，用同樣方法提取各組HCCLM3細胞總RNA，合成cDNA后進行熒光定量PCR，以GAPDH和U6為內(nèi)參，PCR反應(yīng)體系：2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10μl SYBR Green Mix、正反向引物各0.5μl、7μl無菌水；循環(huán)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線：95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。2-ΔΔCt計算相對表達。circ_0046263正向引物序列：5'-ACCATTTGGGATCACTTCCA-3'，反 向引 物 序列：5'-CTTCTTCAGCCAGTTCACGA-3'；GAPDH正向引物序列：5'-GTGAACCATGAGAAGTATG-3'，反向引物序列：5'-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3'；miR-1184正向引物序列：5'-CCTGCAGCGACTTGATGGC-3'，反向引物序列：5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；U6正向引物序列：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCA-3'，反向引物序列：5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3 CCK-8檢測細胞活性取各組對數(shù)生長期HCCLM3細胞，消化后接種至96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入10μl CCK-8試劑孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度（OD）。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數(shù)將各組HCCLM3細胞以200個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)2周，終止培養(yǎng)后PBS洗滌2次，甲醇固定15 min后加入吉姆薩染色液染色30 min，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)＞50個細胞的集落。

1.2.5 劃痕實驗檢測劃痕愈合率取各組對數(shù)生長期細胞，消化后接種于培養(yǎng)皿，待細胞鋪滿皿底后用槍頭劃痕，PBS沖洗，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)0 h和24 h后拍照觀察，Image-Pro Plus 6.0軟件計算劃痕愈合率。

1.2.6 Transwell檢測侵襲細胞數(shù)取100μl稀釋的Matrigel平鋪于Transwell上室，凝固后接種100μl無血清重懸的細胞，下室加入500μl含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，甲醇固定30 min，將小室風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，PBS漂洗，干燥，光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野并計數(shù)。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 提取各組HCCLM3細胞總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入E-cadherin和N-cadherin一抗（1∶800）37℃孵育2 h，加入二抗山羊抗兔IgG（1∶1 500）室溫孵育2 h，暗室曝光顯影，分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白相對表達。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗構(gòu)建circ_0046263野生型（WT-circ_0046263）和突變型（MUT-circ_0046263）熒光素報告酶載體，將miR-NC和miR-1184分別與其共轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞，按照說明書檢測熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circ_0046863、si-NC、si-circ_0046863分別轉(zhuǎn)染至HCCLM3細胞，RT-qPCR檢測miR-1184表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_0046263和miR-1184在肝癌組織中的表達收集肝癌患者癌組織及癌旁組織，RT-qPCR檢測circ_0046263和miR-1184表達，結(jié)果顯示，肝癌組織circ_0046263表達高于癌旁組織，miR-1184表達低于癌旁組織（P＜0.05，表1），表明肝癌組織中circ_0046263呈高表達，而miR-1184呈低表達。

表1 肝癌組織circ_0046263和miR-1184表達（±s，n=47）Tab.1 Expressions of circ_0046263 and miR-1184 in liver cancer tissue（±s，n=47）

表1 肝癌組織circ_0046263和miR-1184表達（±s，n=47）Tab.1 Expressions of circ_0046263 and miR-1184 in liver cancer tissue（±s，n=47）

Note：Compared with adjacent tissues，1）P＜0.05.

Groups Adjacent tissues Liver cancer tissues t P circ_0046263 1.00±0.08 3.53±0.311）32.763 0.000 miR-1184 1.00±0.07 0.33±0.031）60.313 0.000

2.2 抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖的影響RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染si-circ_0046263后circ_0046263表達降低；克隆形成實驗中si-circ_0046263組HCCLM3細胞克隆形成數(shù)少于si-NC組（P＜0.05），CCK-8實驗中，si-circ_0046263組HCCLM3細胞活性低于si-NC組（P＜0.05，圖1、表2），表明抑制circ_0046263表達可抑制HCCLM3細胞增殖和克隆形成。

表2 抑制circ_0046263表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖（±s，n=9）Tab.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits proliferation of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表2 抑制circ_0046263表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖（±s，n=9）Tab.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits proliferation of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-circ_0046263 tP circ_0046263 1.00±0.00 0.24±0.021）114.000 0.000 OD450 0.65±0.04 0.32±0.031）19.800 0.000 Cell clone formation 78.08±6.17 35.06±3.241）18.519 0.000

圖1 抑制circ_0046263表達抑制肝癌HCCLM3細胞克隆形成Fig.1 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits clonal formation of HCCLM3 cells

2.3 抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲的影響轉(zhuǎn)染si-circ_0046263及陰性對照si-NC后，劃痕實驗結(jié)果顯示，si-circ_0046263組HCCLM3細胞劃痕愈合率低于si-NC組，Transwell結(jié)果顯示，si-circ_0046263組HCCLM3細胞侵襲數(shù)少于si-NC組，Western blot結(jié)果顯示，si-circ_0046263組E-cadherin表達高于si-NC組，而N-cadherin表達低于si-NC組（P＜0.05，圖2、表3），表明抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移侵襲。

表3 抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲（±s，n=9）Tab.3 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表3 抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲（±s，n=9）Tab.3 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-circ_0046263 t P Scratch healing rate（%）63.92±5.02 22.53±2.091）22.835 0.000 Invasive cell number 99.61±9.14 42.94±4.121）16.957 0.000 E-cadherin protein 0.13±0.02 0.55±0.041）28.174 0.000 N-cadherin protein 0.66±0.05 0.25±0.021）22.841 0.000

圖2 抑制circ_0046263表達可抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲Fig.2 Inhibition expression of circ_0046263 inhibits migration and invasion of HCCLM3 cells

2.4 circ_0046263靶向調(diào)控miR-1184表達circular RNA Interactome預(yù)測顯示，circ_0046263與miR-1184存在互補核苷酸序列（圖3）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，WT-circ_0046263與miR-1184共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性降低，而MUT-circ_0046263與miR-1184共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性無顯著變化（表4）。RT-qPCR結(jié)果顯示，pcDNAcirc_0046263組miR-1184表 達 低 于pcDNA組；si-circ_0046263組miR-1184表達高于si-NC組（P＜0.05，表5）。表明circ_0046263可靶向調(diào)控miR-1184表達。

圖3 circ_0046263序列中含有與miR-1184互補的核苷酸序列Fig.3 Sequence of circ_0046263 contains a nucleotide sequence complementary to miR-1184

表4 circ_0046263野生型和突變型載體與miR-NC、miR-1184共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Luciferase activity of circ_0046263 wild-type and mutant vectors co-transfected with miR-NC and miR-1184（±s，n=9）

表4 circ_0046263野生型和突變型載體與miR-NC、miR-1184共轉(zhuǎn)染后的熒光素酶活性（±s，n=9）Tab.4 Luciferase activity of circ_0046263 wild-type and mutant vectors co-transfected with miR-NC and miR-1184（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-1184 t P WT-circ_0046263 1.03±0.07 0.61±0.061）13.667 0.000 MUT-circ_0046263 1.04±0.08 1.01±0.06 0.900 0.381

表5 circ_0046263調(diào)控miR-1184表達（±s，n=9）Tab.5 circ_0046263 regulates expression of miR-1184（±s，n=9）

表5 circ_0046263調(diào)控miR-1184表達（±s，n=9）Tab.5 circ_0046263 regulates expression of miR-1184（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P＜0.05；compared with si-NC group，2）P＜0.05.

Groups pcDNA pcDNA-circ_0046263 si-NC si-circ_0046263 F P miR-1184 1.00±0.00 0.38±0.041）0.98±0.06 3.13±0.312）517.276 0.000

2.5 miR-1184過表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的影響RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-1184后，miR-1184表達升高；克隆形成實驗中miR-1184組HCCLM3細胞克隆形成數(shù)少于miR-NC組（P＜0.05），CCK-8實 驗 中，si-circ_0046263組HCCLM3細胞活性低于si-NC組，劃痕實驗結(jié)果顯示，si-circ_0046263組HCCLM3細胞劃痕愈合率低于si-NC組，Transwell結(jié)果顯示，si-circ_0046263組HCCLM3細胞侵襲數(shù)少于si-NC組，Western blot結(jié)果顯示，si-circ_0046263組E-cadherin表達高于si-NC組，而N-cadherin表達低于si-NC組（P＜0.05，圖4、表6）。表明miR-1184過表達可抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲。

表6 miR-1184過表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1184 inhibits proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表6 miR-1184過表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲（±s，n=9）Tab.6 Overexpression of miR-1184 inhibits proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-1184 t P miR-1184 1.00±0.00 2.67±0.221）22.773 0.000 OD450 0.68±0.04 0.39±0.041）15.380 0.000 Cell clone formation 77.81±6.49 42.29±3.621）14.339 0.000 Scratch healing rate（%）64.87±5.19 28.56±3.291）17.727 0.000 Invasive cell number 96.83±8.22 49.67±5.421）14.369 0.000 E-cadherin protein 0.12±0.02 0.48±0.041）24.150 0.000 N-cadherin protein 0.68±0.05 0.30±0.031）19.551 0.000

圖4 miR-1184過表達抑制肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達Fig.4 Overexpression of miR-1184 inhibits expressions of proteins related to migration and invasion of liver cancer HCCLM3 cells

2.6 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用si-circ_0046263與anti-miR-1184共轉(zhuǎn)染后miR-1184表達降低，克隆形成實驗中si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞克隆形成數(shù)多于si-circ_0046263+anti-miR-NC組（P＜0.05），CCK-8結(jié)果顯示，si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞活性高于si-circ_0046263+anti-miR-NC組，劃痕實驗結(jié)果顯示，si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞劃痕愈合率高于si-circ_0046263+antimiR-NC組，Transwell結(jié)果顯示，si-circ_0046263+anti-miR-1184組HCCLM3細胞侵襲數(shù)多于si-circ_0046263+anti-miR-NC組，Western blot結(jié) 果 顯 示，si-circ_0046263+anti-miR-1184組E-cadherin表 達 低于si-circ_0046263+anti-miR-NC組，而N-cadherin表達 高 于si-circ_0046263+anti-miR-NC組（P＜0.05，表7、圖5）。表明下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

表7 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=9）Tab.7 Down-regulation of miR-1184 expression reversed effect of inhibiting circ_0046263 expression on proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

表7 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用（±s，n=9）Tab.7 Down-regulation of miR-1184 expression reversed effect of inhibiting circ_0046263 expression on proliferation，migration and invasion of HCCLM3 cells（±s，n=9）

Note：Compared with si-circ_0046263+anti-miR-NC group，1）P＜0.05.

Groups si-circ_0046263+anti-miR-NC si-circ_0046263+anti-miR-1184 t P miR-1184 1.00±0.00 0.27±0.031）73.000 0.000 OD450 0.31±0.03 0.57±0.041）15.600 0.000 Cell clone formation 33.82±4.58 69.14±6.021）14.008 0.000 Scratch healing rate（%）23.33±2.84 56.09±4.751）17.758 0.000 Invasive cell number 41.36±4.83 86.94±8.121）14.473 0.000 E-cadherin protein 0.57±0.05 0.25±0.021）17.827 0.000 N-cadherin protein 0.22±0.02 0.51±0.041）19.454 0.000

圖5 下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達的作用Fig.5 Down-regulating expression of miR-1184 reversed effect of inhibiting expression of circ_0046263 on expressions of proteins related to migration and invasion of liver cancer HCCLM3 cells

3 討論

近年分子靶向藥物治療已成為肝癌研究熱點，其可明顯改善患者療效；但目前分子靶向治療尚未成熟，急需發(fā)現(xiàn)新的分子靶點以開發(fā)相應(yīng)靶向藥物［9-11］。研究表明，circRNA可通過調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程在肝癌進程中發(fā)揮致癌作用或抑制作用，具有作為預(yù)后生物標志物及肝癌治療靶標的潛力［12］。如circTRIM33-12充當miR-191的海綿，可抑制肝細胞癌增殖、遷移、侵襲和免疫逃逸［13］。circSETD3通過調(diào)控miR-421抑制肝細胞癌生長［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中circ_0046263表達升高，提示circ_0046263在肝癌中起促癌作用。進一步抑制circ_0046263表達后，肝癌細胞HCCLM3活性降低，細胞克隆形成數(shù)減少，細胞劃痕愈合率降低，侵襲細胞數(shù)減少，且E-cadherin表達升高，N-cadherin表達降低，表明抑制circ_0046263表達抑制了肝癌細胞HCCLM3增殖、遷移和侵襲。

研究報道，circ_0128846通過使miR-1184海綿化并釋放AJUBA使Hippo/YAP信號失活，從而促發(fā)結(jié)直腸癌［15］。干擾circBC048201表達可通過miR-1184/ITGA3軸抑制膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲［16］。表明miR-1184不僅影響腫瘤進展，還可被circRNA調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-1184呈低表達，過表達miR-1184后，肝癌細胞HCCLM3活性降低，細胞克隆形成數(shù)減少，細胞劃痕愈合率降低，侵襲細胞數(shù)減少，E-cadherin表達升高，N-cadherin表達降低；說明過表達miR-1184可抑制肝癌細胞進展。本研究還發(fā)現(xiàn)circ_0046263靶向調(diào)控miR-1184表達；下調(diào)miR-1184表達逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0046263表達對肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，抑制circ_0046263表達可能通過靶向上調(diào)miR-1184表達抑制肝癌HCCLM3細胞增殖、遷移和侵襲。