• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    組胺通過Hippo-YAP信號(hào)通路影響鼻咽癌細(xì)胞增殖與侵襲的機(jī)制研究①

    2022-11-15 09:03:04冼德生曾銀萍周小柳李智群王麗萍羊俊維
    中國免疫學(xué)雜志 2022年17期
    關(guān)鍵詞:恒濕膜電位組胺

    冼德生 曾銀萍 周小柳 李智群 王麗萍 羊俊維

    (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,???570102)

    鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一[1]。目前主要以放化療來幫助患者緩解臨床不適,但腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響患者的預(yù)后,因此深入揭示疾病的分子發(fā)展機(jī)制,尋找有效的抗腫瘤藥物對(duì)改善鼻咽癌患者的生命質(zhì)量具有重大意義[2-3]。組胺是一種由肥大細(xì)胞、血小板及T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的物質(zhì)。研究顯示,組胺參與細(xì)胞增殖、學(xué)習(xí)記憶、胃腸循環(huán)、炎癥應(yīng)激、變態(tài)反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等多種生理病理過程[4]。NICOUD等[5]研究報(bào)道,外源性補(bǔ)充組胺可明顯降低乳腺癌細(xì)胞的線粒體膜電位,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但有關(guān)組胺在鼻咽癌中的應(yīng)用報(bào)道較少。果蠅中的蛋白激酶Hippo-Yes協(xié)同蛋白(YAP)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)高度保守的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路主要通過大腫瘤抑制基因1(large tumor suppressor gene 1,LATS1)的甲基化及YAP的磷酸化發(fā)揮生物學(xué)效用。研究顯示,該通路參與調(diào)控肺癌、結(jié)腸癌、肝癌及食管癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲與惡性轉(zhuǎn)移、化療耐藥等生物學(xué)過程[6]。孫海力等[7]通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中鼻咽癌組織數(shù)據(jù)進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),Hippo-YAP信號(hào)在鼻咽癌組織中表達(dá)異常,參與鼻咽癌的病情進(jìn)展。本研究通過對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1的研究,從Hippo-YAP信號(hào)入手,觀察外源性組胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制,以期為臨床鼻咽癌的治療提供新的數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)雄性SD大鼠裸鼠,6~8周齡,體質(zhì)量130~180 g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2020-0006。

    1.1.3 主要試劑組胺(>97%,5 g/瓶,美國Sigma公司);鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Jackson公司);CCK-8試劑盒、Western blot試劑盒(美國Invitrogen公司);Transwell小室(美國Sigma-Aldrich公司)。

    1.1.4 主要儀器蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司);BD-56集成式恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國BINDER公司);IXplore Standard倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及分組處理將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1復(fù)蘇后,接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設(shè)定條件:37℃、5%CO2,取對(duì)數(shù)生長期的組胺進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組:正常組、組胺低、中、高劑量組;其中,正常組不添加任何藥物常規(guī)培養(yǎng);組胺低、中、高劑量組依次添加100、200、400μmol/L的組胺[8]。

    1.2.2 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)調(diào)整細(xì)胞濃度,以2×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板,分組處理同1.2.1,輕輕混勻后,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定,室溫下添加DAPI(15μg/ml)500μl,避光染色,干燥后上鏡觀察。

    1.2.3 CCK-8法檢測各組CNE1細(xì)胞增殖以1×105個(gè)/孔將CNE1細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞分組同1.2.1,每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,每孔加入20μl CCK-8溶液,室溫下孵育5 h,Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀檢測A450。細(xì)胞增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白組孔)/A實(shí)驗(yàn)孔×100%[9]。

    1.2.4 Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲在Transwell小室上室加入200μl預(yù)先稀釋的不含血清的Matrigel膠,無菌干燥箱中過夜。調(diào)整各組細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/孔接種于上室,下室中加入700μl含血清的常規(guī)培養(yǎng)基,每組設(shè)8個(gè)孔,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS輕柔洗滌1次,4%多聚甲醛固定10 min,結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù),采用圖像處理軟件Image-Pro Plus6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.5 四氯四乙基苯并咪唑羰花青(JC-1)染色檢測各組細(xì)胞的線粒體膜電位調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×106個(gè)/孔接種于6孔板,分組處理同1.2.1,每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS沖洗3次,分別收集各組細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,300μl JC-1進(jìn)行染色,室溫避光孵育30 min,觀察各組細(xì)胞中紅色(JC-1單體)和綠色熒光(JC-1復(fù)合物)變化,以紅色熒光和綠色熒光的比值評(píng)價(jià)各組細(xì)胞線粒體膜電位變化[10]。

    1.2.6 建立皮下移植瘤裸鼠模型調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×105個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,分組處理同1.2.1,輕輕混勻后,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,待生長密度達(dá)到1×106個(gè)/ml時(shí)消化細(xì)胞,分別制成單細(xì)胞懸液待用。按隨機(jī)數(shù)字法將裸鼠分為正常組、組胺低、中、高劑量組,將上述各組細(xì)胞懸液接種于裸鼠左前腋皮下,構(gòu)建鼻咽癌皮下移植瘤裸鼠模型,標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水喂養(yǎng)裸鼠,在第5天后可觀察到原位腫瘤[11],在接種14 d后處死裸鼠,剝離瘤組織,稱量瘤組織質(zhì)量。

    1.2.7 特異性PCR檢測各組細(xì)胞中LATS1甲基化水平胰酶消化細(xì)胞,離心稀釋成細(xì)胞懸液,分組處理同上,以1×105個(gè)/孔接種至6孔板;置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,提取各組細(xì)胞總DNA,進(jìn)行經(jīng)亞硫酸鹽處理純化,采用甲基化特異性PCR擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析目的基因的甲基化水平。甲基化引物序列如下[12]:正向引物5'-CACACTGAACCCCCTCATCT-3',反向引物5'-ATTTTGTTGCATCCCCTCAG-3';非甲基化引物序列如下:正向引物5'-ACCAGCAAGGGCAATCATAC-3',反向引物5'-CATGATCAGTAGCGGGAGGT-3';擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性10 min,單次循環(huán);94℃變性30 s;甲基化/非甲基化:53℃/57℃;72℃退火45 s,60℃延伸60 s,采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。

    1.2.8 Western blot檢測各組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1的表達(dá)胰酶消化細(xì)胞,離心稀釋成細(xì)胞懸液,分組處理同上,以1×105個(gè)/孔接種至6孔板;置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,加入蛋白裂解液,常規(guī)提取總蛋白,測定濃度,置于沸水中變性,進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)膜,清洗后,在封閉液中孵育30 min,加入一抗(1∶500),孵育過夜,加入二抗(1∶1 000),二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色[13]。以GAPDH為內(nèi)參,Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析各條帶灰度值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件,作圖工具采用Graphpad5.01,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞形態(tài)的影響DAPI染色結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞染色后呈現(xiàn)出均勻淺藍(lán)色光,核質(zhì)界限清晰,核膜完整,核質(zhì)均勻,低、中、高劑量組細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡狀態(tài)改變,且隨著組胺濃度升高,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞核膜破裂數(shù)量及染色質(zhì)固縮程度明顯加劇,見圖1。

    圖1 DAPI染色結(jié)果(×200)Fig.1 Result of DAPI staining(×200)

    2.2 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞增殖率明顯下降(分別為P=0.001、P=0.000、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖2。

    圖2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of cell proliferation

    2.3 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞的侵襲的影響Transwell小室侵襲結(jié)果顯示,與正常組相比,細(xì)胞低、中、高劑量組細(xì)胞穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖3。

    圖3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)Fig.3 Result of cell invasion(×200)

    2.4 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞線粒體膜電位的影響JC-1染色結(jié)果顯示,正常組細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的紅色熒光,細(xì)胞低、中、高劑量組紅色熒光逐漸減弱,綠色熒光逐漸增強(qiáng);與正常組相比,細(xì)胞低、中、高劑量組細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光比值明顯降低(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),線粒體膜電位隨之下降,且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖4。

    圖4 JC-1染色結(jié)果(×200)Fig.4 Result of JC-1 staining(×200)

    2.5 組胺對(duì)裸鼠皮下移植瘤成瘤的影響皮下移植瘤結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞皮下成瘤組織質(zhì)量明顯降低(分別為P=0.002、P=0.001、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖5。

    圖5 各組裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量比較Fig.5 Comparison of weight of subcutaneously transplanted tumor in each group of nude mice

    2.6 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞中LATS1甲基化的影響特異性PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞中LATS1基因的甲基化比例明顯降低(分別為P=0.001、P=0.001、P=0.001),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖6。

    圖6 各組LATS1基因的甲基化水平Fig.6 Methylation level of LATS1 gene in each group of cell

    2.7 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1表達(dá)明顯減少(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),細(xì)胞中LATS1表達(dá)明顯增多(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),且具有明顯劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖7。

    圖7 各組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1的表達(dá)Fig.7 Expressions of YAP1,p-YAP1 and LATS1 in each group of cell

    3 討論

    常見于我國華南地區(qū)及東南亞的鼻咽癌是一種惡性程度較高的頭頸部腫瘤。該病尚無根治性措施使患者免受疾病困擾,盡管現(xiàn)有的早期干預(yù)和輔助治療手段有了較為明顯的進(jìn)步,但處于該病晚期的患者預(yù)后仍不令人滿意,五年生存率較低[14]。腫瘤細(xì)胞的無限增殖及遠(yuǎn)處惡性轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗、失去生命的主要原因。因此深入揭示疾病的分子機(jī)制,尋找或開發(fā)新的治療藥物,更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床上鼻咽癌的治療,提高患者的生命質(zhì)量,都具有重大意義。

    由組胺酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)將組胺酸脫羧基而成的組胺是機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控元件[15]。研究顯示內(nèi)源性組胺的功能影響造血過程、胚胎發(fā)育、傷口愈合、細(xì)胞增殖與分化、免疫調(diào)節(jié)及各種炎癥性應(yīng)激等生理機(jī)能[16]。但近來組胺與惡性腫瘤的關(guān)系引起眾多研究者的重視。LEE等[17]研究報(bào)道內(nèi)源性的組胺水平能夠評(píng)估胃癌、肺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性實(shí)體腫瘤的病情進(jìn)展;GRAUERS等[18]研究報(bào)道外源性組胺可靶向抑制乳腺癌細(xì)胞中的PD-1/PD-L1位點(diǎn),抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促使其凋亡,發(fā)揮良好的抗腫瘤效用。LIM等[19]研究表明外源性組胺不僅能夠增強(qiáng)化療藥物如甲氨蝶呤、吉西他濱對(duì)腎細(xì)胞癌組織的滲透作用,還可減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟、直腸等靶器官的轉(zhuǎn)移。MASSARI等[20]報(bào)道外源性組胺能促使Treg/Th17趨于平衡,明顯改善肝癌荷瘤小鼠的免疫功能,促進(jìn)IL-10等抗腫瘤因子的釋放。SHI等[21]研究證實(shí)在炎癥性相關(guān)結(jié)腸癌動(dòng)物模型中,補(bǔ)充外源性組胺能夠促使腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降,促使腫瘤細(xì)胞能量代謝失衡,抑制腫瘤組織生長。本研究結(jié)果顯示,與正常組鼻咽癌細(xì)胞相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞增殖明顯減少,細(xì)胞侵襲能力明顯減弱,線粒體膜電位明顯降低,腫瘤體內(nèi)生長能力明顯受限,這些結(jié)果均提示組胺具有良好的抗腫瘤作用,但其是否能夠改善鼻咽癌患者的免疫能力是下一步實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

    深入了解藥物的作用靶點(diǎn)有助于揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。Hippo-YAP信號(hào)是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的通路[22]。該通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心是激酶的級(jí)聯(lián)磷酸化。DEY等[23]研究顯示,在結(jié)腸癌、腎癌中,位于Hippo信號(hào)上游的LATS1基因發(fā)生甲基化可導(dǎo)致通路內(nèi)一系列激酶發(fā)生級(jí)聯(lián)磷酸化,最終導(dǎo)致下游YAP蛋白的磷酸化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖。TANG等[24]研究報(bào)道抑制Hippo通路中YAP蛋白的激活,能明顯抑制胃癌細(xì)胞的線粒體功能,阻斷腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化所需的能量代謝過程,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。CHEN等[25]研究證實(shí)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的LATS1基因發(fā)生去甲基化能夠阻止YAP信號(hào)入核,下調(diào)腫瘤生長與侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,抑制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞LATS1基因甲基化比例及YAP1、p-YAP1表達(dá)均明顯下降,LATS1表達(dá)明顯升高。說明組胺對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用是通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

    綜合上述,組胺能抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的體外增殖與侵襲能力,降低其線粒體膜電位,使腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長明顯受限,這可能是通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。組胺如何通過改善鼻咽癌患者免疫功能發(fā)揮綜合抗瘤功效將是下一步的研究重點(diǎn)。

    猜你喜歡
    恒濕膜電位組胺
    有關(guān)動(dòng)作電位的“4坐標(biāo)2比較”
    參芪復(fù)方對(duì)GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關(guān)促凋亡蛋白的影響研究
    實(shí)現(xiàn)廠房恒溫恒濕環(huán)境的途徑分析
    兒童醫(yī)院門診口服抗組胺藥應(yīng)用情況分析
    混凝土試件標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)護(hù)裝置設(shè)計(jì)
    節(jié)能型高精度恒溫恒濕機(jī)組的特點(diǎn)及控制方法研究
    評(píng)價(jià)3種抗組胺藥治療慢性特發(fā)性蕁麻疹的療效
    魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位變化
    恒溫恒濕空調(diào)三種工況下自動(dòng)控制研究
    科技視界(2014年3期)2014-03-01 03:31:54
    柱前衍生-高效液相色譜法測定魚粉中組胺的含量
    国产成人系列免费观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美97在线视频| 韩国精品一区二区三区| 老司机靠b影院| a 毛片基地| 色婷婷久久久亚洲欧美| av在线播放精品| 我的亚洲天堂| 丝袜人妻中文字幕| 99国产精品免费福利视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 少妇 在线观看| 曰老女人黄片| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 一边摸一边做爽爽视频免费| av电影中文网址| 99久久99久久久精品蜜桃| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲伊人久久精品综合| 性少妇av在线| av福利片在线| 欧美日韩一级在线毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产成人影院久久av| 电影成人av| 男女免费视频国产| 国产亚洲精品久久久久5区| 日韩视频一区二区在线观看| 在线天堂中文资源库| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 9热在线视频观看99| 欧美性长视频在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 91精品伊人久久大香线蕉| 色视频在线一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成年女人毛片免费观看观看9 | 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲国产av影院在线观看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲人成电影观看| 老司机影院毛片| 久久女婷五月综合色啪小说| 黄色视频,在线免费观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 五月开心婷婷网| 91成年电影在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 精品乱码久久久久久99久播| 欧美在线黄色| 日韩视频在线欧美| 欧美精品高潮呻吟av久久| 成年av动漫网址| 久久久久久久国产电影| 欧美 日韩 精品 国产| 男人舔女人的私密视频| 婷婷成人精品国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产一级毛片在线| 成人av一区二区三区在线看 | 美女大奶头黄色视频| 免费观看人在逋| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 他把我摸到了高潮在线观看 | 美女午夜性视频免费| 一区福利在线观看| 午夜福利一区二区在线看| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久网色| netflix在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产黄频视频在线观看| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人黄色视频免费在线看| 欧美日韩一级在线毛片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 久9热在线精品视频| 成人黄色视频免费在线看| 91国产中文字幕| 一区二区三区精品91| 青草久久国产| 久久久久久久久久久久大奶| 又大又爽又粗| 日韩大码丰满熟妇| 制服诱惑二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 极品人妻少妇av视频| 亚洲国产欧美在线一区| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 窝窝影院91人妻| 国产99久久九九免费精品| 精品少妇久久久久久888优播| 日日爽夜夜爽网站| 午夜日韩欧美国产| 国产1区2区3区精品| 在线观看免费高清a一片| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲av美国av| 十八禁高潮呻吟视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日本五十路高清| 国产在线观看jvid| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产精品二区激情视频| av有码第一页| 国产成人精品无人区| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品亚洲av一区麻豆| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美精品av麻豆av| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 麻豆av在线久日| 在线观看一区二区三区激情| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 69精品国产乱码久久久| 麻豆av在线久日| 日本一区二区免费在线视频| 国产亚洲欧美精品永久| 中国国产av一级| 一级毛片女人18水好多| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品福利观看| 激情视频va一区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 男女午夜视频在线观看| 久久久欧美国产精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久久久国内视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 两人在一起打扑克的视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日日夜夜操网爽| 咕卡用的链子| 国产视频一区二区在线看| 自线自在国产av| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91成年电影在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩黄片免| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 男人添女人高潮全过程视频| 一级黄色大片毛片| 精品卡一卡二卡四卡免费| 伦理电影免费视频| 极品人妻少妇av视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 一二三四社区在线视频社区8| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 嫁个100分男人电影在线观看| 免费观看人在逋| 成年人免费黄色播放视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 不卡一级毛片| 成年人午夜在线观看视频| 丁香六月欧美| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 51午夜福利影视在线观看| 午夜福利在线观看吧| 少妇人妻久久综合中文| 91大片在线观看| 亚洲专区字幕在线| 韩国高清视频一区二区三区| 在线观看人妻少妇| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品一二三区在线看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩视频在线欧美| 在线天堂中文资源库| 日本a在线网址| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 伦理电影免费视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 天堂俺去俺来也www色官网| av天堂在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲av日韩在线播放| 日本一区二区免费在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一本久久精品| 精品福利观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 两个人免费观看高清视频| 啦啦啦 在线观看视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 涩涩av久久男人的天堂| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 香蕉丝袜av| av一本久久久久| 免费观看av网站的网址| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| www.999成人在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 午夜免费观看性视频| 国产av一区二区精品久久| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 天堂中文最新版在线下载| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩中文字幕欧美一区二区| 俄罗斯特黄特色一大片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 色94色欧美一区二区| 大码成人一级视频| 下体分泌物呈黄色| 国产精品一区二区在线观看99| 精品欧美一区二区三区在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久免费观看电影| 咕卡用的链子| 国产一区二区三区综合在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产一级毛片在线| a级毛片在线看网站| 91成人精品电影| 黑人欧美特级aaaaaa片| 91大片在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产在视频线精品| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产成人精品在线电影| www.av在线官网国产| 免费观看人在逋| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲专区中文字幕在线| 91大片在线观看| 无人区码免费观看不卡| 国产精品久久视频播放| 夜夜爽天天搞| 欧美黄色片欧美黄色片| 看免费av毛片| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费在线观看黄色视频的| 最近在线观看免费完整版| 看片在线看免费视频| 国产免费男女视频| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 国产av一区二区精品久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人午夜高清在线视频| 在线观看日韩欧美| 国产高清videossex| 日韩免费av在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99国产精品99久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久| 中文字幕熟女人妻在线| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费看日本二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲专区字幕在线| 久热爱精品视频在线9| 成人国产一区最新在线观看| 国产一区二区在线观看日韩 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产成人欧美在线观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| cao死你这个sao货| 搞女人的毛片| 欧美性猛交黑人性爽| 久久国产精品人妻蜜桃| 黄色女人牲交| 美女扒开内裤让男人捅视频| 美女大奶头视频| 久久九九热精品免费| 精品福利观看| 嫩草影院精品99| 亚洲人成网站高清观看| 免费电影在线观看免费观看| 日本三级黄在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲精品在线美女| 一本久久中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本免费a在线| 国产激情欧美一区二区| 亚洲熟妇熟女久久| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品乱码久久久久久99久播| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲国产看品久久| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲真实伦在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 好男人电影高清在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产成人欧美在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 很黄的视频免费| 两个人的视频大全免费| 国产av又大| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美乱色亚洲激情| 香蕉丝袜av| 色综合婷婷激情| 波多野结衣高清作品| 色精品久久人妻99蜜桃| 青草久久国产| 美女黄网站色视频| 亚洲性夜色夜夜综合| svipshipincom国产片| www日本在线高清视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲av熟女| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品免费视频内射| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲成人免费电影在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 制服诱惑二区| xxx96com| 午夜视频精品福利| 久久香蕉激情| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜精品在线福利| 亚洲一区二区三区色噜噜| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 岛国在线观看网站| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 搞女人的毛片| 国产成人精品无人区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产一区二区激情短视频| 两个人看的免费小视频| 免费在线观看完整版高清| 在线播放国产精品三级| 国产欧美日韩一区二区三| 成人18禁在线播放| 久久精品国产清高在天天线| 一本精品99久久精品77| 精品乱码久久久久久99久播| 中文字幕久久专区| videosex国产| 黑人操中国人逼视频| 午夜福利免费观看在线| 黑人操中国人逼视频| 在线观看一区二区三区| 亚洲18禁久久av| 久久天堂一区二区三区四区| 国产欧美日韩一区二区精品| 两个人看的免费小视频| 老司机在亚洲福利影院| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| 在线观看www视频免费| 成在线人永久免费视频| 欧美3d第一页| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美性长视频在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美丝袜亚洲另类 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 日韩中文字幕欧美一区二区| 嫩草影院精品99| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品人妻1区二区| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品国产高清国产av| 国产午夜精品久久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜视频精品福利| 禁无遮挡网站| 一二三四在线观看免费中文在| 深夜精品福利| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品久久久久久,| 午夜老司机福利片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一级a爱片免费观看的视频| 两性夫妻黄色片| www日本在线高清视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 91老司机精品| 亚洲激情在线av| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美日本亚洲视频在线播放| 99热6这里只有精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 一边摸一边抽搐一进一小说| 麻豆一二三区av精品| 1024香蕉在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久久久亚洲av毛片大全| 成人手机av| 精品不卡国产一区二区三区| 香蕉丝袜av| 亚洲免费av在线视频| 一区二区三区高清视频在线| 久久亚洲真实| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲国产欧美网| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 很黄的视频免费| 久久久久久九九精品二区国产 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美黑人巨大hd| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 99re在线观看精品视频| 在线观看66精品国产| 一个人免费在线观看的高清视频| 九色成人免费人妻av| www国产在线视频色| 国产爱豆传媒在线观看 | 国产探花在线观看一区二区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线看三级毛片| 小说图片视频综合网站| 黄频高清免费视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品一区二区三区av网在线观看| 两个人免费观看高清视频| 女人被狂操c到高潮| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产高清视频在线播放一区| 日本一二三区视频观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品一及| 怎么达到女性高潮| 国产精品av久久久久免费| 免费无遮挡裸体视频| 国产av又大| 男女午夜视频在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 9191精品国产免费久久| 亚洲精华国产精华精| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产69精品久久久久777片 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品色激情综合| 国产亚洲精品av在线| 日韩av在线大香蕉| 少妇粗大呻吟视频| 老司机福利观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产亚洲精品一区二区www| 免费搜索国产男女视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产成人欧美在线观看| 88av欧美| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 午夜福利视频1000在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 成人亚洲精品av一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 18美女黄网站色大片免费观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲 国产 在线| 1024视频免费在线观看| 日本熟妇午夜| 一夜夜www| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 波多野结衣高清作品| 日韩大尺度精品在线看网址| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久热在线av| 日韩欧美三级三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 精品一区二区三区视频在线观看免费| videosex国产| 国产激情欧美一区二区| 亚洲,欧美精品.| 国产69精品久久久久777片 | 亚洲色图av天堂| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产视频一区二区在线看| 久久久久国内视频| 熟女电影av网| 高清毛片免费观看视频网站| 熟女电影av网| 精品欧美国产一区二区三| 一进一出抽搐gif免费好疼| bbb黄色大片| av天堂在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久国产成人精品二区| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲成人国产一区在线观看| 窝窝影院91人妻| 久久亚洲真实| 波多野结衣高清无吗| 国产人伦9x9x在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 动漫黄色视频在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品免费一区二区三区在线| 一本综合久久免费| 后天国语完整版免费观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲精华国产精华精| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久人妻av系列| 免费看美女性在线毛片视频| 色哟哟哟哟哟哟| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲色图av天堂| 很黄的视频免费| 久久久久久久久久黄片| 国产免费男女视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av在线播放免费不卡| 中文字幕av在线有码专区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 色在线成人网| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久久久久精品吃奶| 999久久久国产精品视频| 伦理电影免费视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 午夜福利高清视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩欧美免费精品| 两个人的视频大全免费| 国产精品永久免费网站| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 俺也久久电影网| av国产免费在线观看| 成人精品一区二区免费| 日韩大码丰满熟妇| 在线视频色国产色| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 麻豆av在线久日| 国产亚洲精品第一综合不卡| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美zozozo另类| 两个人的视频大全免费| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲精品在线美女| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美性猛交╳xxx乱大交人|