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    組胺通過Hippo-YAP信號(hào)通路影響鼻咽癌細(xì)胞增殖與侵襲的機(jī)制研究①

    2022-11-15 09:03:04冼德生曾銀萍周小柳李智群王麗萍羊俊維
    中國免疫學(xué)雜志 2022年17期
    關(guān)鍵詞:恒濕膜電位組胺

    冼德生 曾銀萍 周小柳 李智群 王麗萍 羊俊維

    (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,???570102)

    鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一[1]。目前主要以放化療來幫助患者緩解臨床不適,但腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響患者的預(yù)后,因此深入揭示疾病的分子發(fā)展機(jī)制,尋找有效的抗腫瘤藥物對(duì)改善鼻咽癌患者的生命質(zhì)量具有重大意義[2-3]。組胺是一種由肥大細(xì)胞、血小板及T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的物質(zhì)。研究顯示,組胺參與細(xì)胞增殖、學(xué)習(xí)記憶、胃腸循環(huán)、炎癥應(yīng)激、變態(tài)反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)等多種生理病理過程[4]。NICOUD等[5]研究報(bào)道,外源性補(bǔ)充組胺可明顯降低乳腺癌細(xì)胞的線粒體膜電位,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但有關(guān)組胺在鼻咽癌中的應(yīng)用報(bào)道較少。果蠅中的蛋白激酶Hippo-Yes協(xié)同蛋白(YAP)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)高度保守的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路主要通過大腫瘤抑制基因1(large tumor suppressor gene 1,LATS1)的甲基化及YAP的磷酸化發(fā)揮生物學(xué)效用。研究顯示,該通路參與調(diào)控肺癌、結(jié)腸癌、肝癌及食管癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲與惡性轉(zhuǎn)移、化療耐藥等生物學(xué)過程[6]。孫海力等[7]通過對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中鼻咽癌組織數(shù)據(jù)進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn),Hippo-YAP信號(hào)在鼻咽癌組織中表達(dá)異常,參與鼻咽癌的病情進(jìn)展。本研究通過對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1的研究,從Hippo-YAP信號(hào)入手,觀察外源性組胺對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制,以期為臨床鼻咽癌的治療提供新的數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只SPF級(jí)雄性SD大鼠裸鼠,6~8周齡,體質(zhì)量130~180 g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2020-0006。

    1.1.3 主要試劑組胺(>97%,5 g/瓶,美國Sigma公司);鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Jackson公司);CCK-8試劑盒、Western blot試劑盒(美國Invitrogen公司);Transwell小室(美國Sigma-Aldrich公司)。

    1.1.4 主要儀器蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司);BD-56集成式恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國BINDER公司);IXplore Standard倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及分組處理將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1復(fù)蘇后,接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng),設(shè)定條件:37℃、5%CO2,取對(duì)數(shù)生長期的組胺進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為4組:正常組、組胺低、中、高劑量組;其中,正常組不添加任何藥物常規(guī)培養(yǎng);組胺低、中、高劑量組依次添加100、200、400μmol/L的組胺[8]。

    1.2.2 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色觀察各組細(xì)胞形態(tài)調(diào)整細(xì)胞濃度,以2×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板,分組處理同1.2.1,輕輕混勻后,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定,室溫下添加DAPI(15μg/ml)500μl,避光染色,干燥后上鏡觀察。

    1.2.3 CCK-8法檢測各組CNE1細(xì)胞增殖以1×105個(gè)/孔將CNE1細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞分組同1.2.1,每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,每孔加入20μl CCK-8溶液,室溫下孵育5 h,Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀檢測A450。細(xì)胞增殖率(%)=(A實(shí)驗(yàn)孔-A空白組孔)/A實(shí)驗(yàn)孔×100%[9]。

    1.2.4 Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲在Transwell小室上室加入200μl預(yù)先稀釋的不含血清的Matrigel膠,無菌干燥箱中過夜。調(diào)整各組細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/孔接種于上室,下室中加入700μl含血清的常規(guī)培養(yǎng)基,每組設(shè)8個(gè)孔,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS輕柔洗滌1次,4%多聚甲醛固定10 min,結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù),采用圖像處理軟件Image-Pro Plus6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    1.2.5 四氯四乙基苯并咪唑羰花青(JC-1)染色檢測各組細(xì)胞的線粒體膜電位調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×106個(gè)/孔接種于6孔板,分組處理同1.2.1,每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,PBS沖洗3次,分別收集各組細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,300μl JC-1進(jìn)行染色,室溫避光孵育30 min,觀察各組細(xì)胞中紅色(JC-1單體)和綠色熒光(JC-1復(fù)合物)變化,以紅色熒光和綠色熒光的比值評(píng)價(jià)各組細(xì)胞線粒體膜電位變化[10]。

    1.2.6 建立皮下移植瘤裸鼠模型調(diào)整細(xì)胞濃度,以1×105個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板,分組處理同1.2.1,輕輕混勻后,置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,待生長密度達(dá)到1×106個(gè)/ml時(shí)消化細(xì)胞,分別制成單細(xì)胞懸液待用。按隨機(jī)數(shù)字法將裸鼠分為正常組、組胺低、中、高劑量組,將上述各組細(xì)胞懸液接種于裸鼠左前腋皮下,構(gòu)建鼻咽癌皮下移植瘤裸鼠模型,標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水喂養(yǎng)裸鼠,在第5天后可觀察到原位腫瘤[11],在接種14 d后處死裸鼠,剝離瘤組織,稱量瘤組織質(zhì)量。

    1.2.7 特異性PCR檢測各組細(xì)胞中LATS1甲基化水平胰酶消化細(xì)胞,離心稀釋成細(xì)胞懸液,分組處理同上,以1×105個(gè)/孔接種至6孔板;置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,提取各組細(xì)胞總DNA,進(jìn)行經(jīng)亞硫酸鹽處理純化,采用甲基化特異性PCR擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析目的基因的甲基化水平。甲基化引物序列如下[12]:正向引物5'-CACACTGAACCCCCTCATCT-3',反向引物5'-ATTTTGTTGCATCCCCTCAG-3';非甲基化引物序列如下:正向引物5'-ACCAGCAAGGGCAATCATAC-3',反向引物5'-CATGATCAGTAGCGGGAGGT-3';擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性10 min,單次循環(huán);94℃變性30 s;甲基化/非甲基化:53℃/57℃;72℃退火45 s,60℃延伸60 s,采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)。

    1.2.8 Western blot檢測各組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1的表達(dá)胰酶消化細(xì)胞,離心稀釋成細(xì)胞懸液,分組處理同上,以1×105個(gè)/孔接種至6孔板;置于恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,加入蛋白裂解液,常規(guī)提取總蛋白,測定濃度,置于沸水中變性,進(jìn)行電泳分離,轉(zhuǎn)膜,清洗后,在封閉液中孵育30 min,加入一抗(1∶500),孵育過夜,加入二抗(1∶1 000),二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色[13]。以GAPDH為內(nèi)參,Image J圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析各條帶灰度值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件,作圖工具采用Graphpad5.01,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞形態(tài)的影響DAPI染色結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞染色后呈現(xiàn)出均勻淺藍(lán)色光,核質(zhì)界限清晰,核膜完整,核質(zhì)均勻,低、中、高劑量組細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡狀態(tài)改變,且隨著組胺濃度升高,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞核膜破裂數(shù)量及染色質(zhì)固縮程度明顯加劇,見圖1。

    圖1 DAPI染色結(jié)果(×200)Fig.1 Result of DAPI staining(×200)

    2.2 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞增殖率明顯下降(分別為P=0.001、P=0.000、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖2。

    圖2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of cell proliferation

    2.3 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞的侵襲的影響Transwell小室侵襲結(jié)果顯示,與正常組相比,細(xì)胞低、中、高劑量組細(xì)胞穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯減少(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖3。

    圖3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×200)Fig.3 Result of cell invasion(×200)

    2.4 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞線粒體膜電位的影響JC-1染色結(jié)果顯示,正常組細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的紅色熒光,細(xì)胞低、中、高劑量組紅色熒光逐漸減弱,綠色熒光逐漸增強(qiáng);與正常組相比,細(xì)胞低、中、高劑量組細(xì)胞紅色熒光與綠色熒光比值明顯降低(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),線粒體膜電位隨之下降,且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖4。

    圖4 JC-1染色結(jié)果(×200)Fig.4 Result of JC-1 staining(×200)

    2.5 組胺對(duì)裸鼠皮下移植瘤成瘤的影響皮下移植瘤結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞皮下成瘤組織質(zhì)量明顯降低(分別為P=0.002、P=0.001、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖5。

    圖5 各組裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量比較Fig.5 Comparison of weight of subcutaneously transplanted tumor in each group of nude mice

    2.6 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞中LATS1甲基化的影響特異性PCR結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞中LATS1基因的甲基化比例明顯降低(分別為P=0.001、P=0.001、P=0.001),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖6。

    圖6 各組LATS1基因的甲基化水平Fig.6 Methylation level of LATS1 gene in each group of cell

    2.7 組胺對(duì)CNE1細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1表達(dá)明顯減少(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),且具有明顯的劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),細(xì)胞中LATS1表達(dá)明顯增多(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),且具有明顯劑量依賴性(分別為P=0.000、P=0.000、P=0.000),見圖7。

    圖7 各組細(xì)胞中YAP1、p-YAP1、LATS1的表達(dá)Fig.7 Expressions of YAP1,p-YAP1 and LATS1 in each group of cell

    3 討論

    常見于我國華南地區(qū)及東南亞的鼻咽癌是一種惡性程度較高的頭頸部腫瘤。該病尚無根治性措施使患者免受疾病困擾,盡管現(xiàn)有的早期干預(yù)和輔助治療手段有了較為明顯的進(jìn)步,但處于該病晚期的患者預(yù)后仍不令人滿意,五年生存率較低[14]。腫瘤細(xì)胞的無限增殖及遠(yuǎn)處惡性轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗、失去生命的主要原因。因此深入揭示疾病的分子機(jī)制,尋找或開發(fā)新的治療藥物,更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床上鼻咽癌的治療,提高患者的生命質(zhì)量,都具有重大意義。

    由組胺酸脫羧酶(histidine decarboxylase,HDC)將組胺酸脫羧基而成的組胺是機(jī)體內(nèi)免疫反應(yīng)中重要的調(diào)控元件[15]。研究顯示內(nèi)源性組胺的功能影響造血過程、胚胎發(fā)育、傷口愈合、細(xì)胞增殖與分化、免疫調(diào)節(jié)及各種炎癥性應(yīng)激等生理機(jī)能[16]。但近來組胺與惡性腫瘤的關(guān)系引起眾多研究者的重視。LEE等[17]研究報(bào)道內(nèi)源性的組胺水平能夠評(píng)估胃癌、肺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等惡性實(shí)體腫瘤的病情進(jìn)展;GRAUERS等[18]研究報(bào)道外源性組胺可靶向抑制乳腺癌細(xì)胞中的PD-1/PD-L1位點(diǎn),抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促使其凋亡,發(fā)揮良好的抗腫瘤效用。LIM等[19]研究表明外源性組胺不僅能夠增強(qiáng)化療藥物如甲氨蝶呤、吉西他濱對(duì)腎細(xì)胞癌組織的滲透作用,還可減弱腫瘤細(xì)胞對(duì)肝臟、直腸等靶器官的轉(zhuǎn)移。MASSARI等[20]報(bào)道外源性組胺能促使Treg/Th17趨于平衡,明顯改善肝癌荷瘤小鼠的免疫功能,促進(jìn)IL-10等抗腫瘤因子的釋放。SHI等[21]研究證實(shí)在炎癥性相關(guān)結(jié)腸癌動(dòng)物模型中,補(bǔ)充外源性組胺能夠促使腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降,促使腫瘤細(xì)胞能量代謝失衡,抑制腫瘤組織生長。本研究結(jié)果顯示,與正常組鼻咽癌細(xì)胞相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞增殖明顯減少,細(xì)胞侵襲能力明顯減弱,線粒體膜電位明顯降低,腫瘤體內(nèi)生長能力明顯受限,這些結(jié)果均提示組胺具有良好的抗腫瘤作用,但其是否能夠改善鼻咽癌患者的免疫能力是下一步實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)。

    深入了解藥物的作用靶點(diǎn)有助于揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制。Hippo-YAP信號(hào)是新近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切的通路[22]。該通路進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心是激酶的級(jí)聯(lián)磷酸化。DEY等[23]研究顯示,在結(jié)腸癌、腎癌中,位于Hippo信號(hào)上游的LATS1基因發(fā)生甲基化可導(dǎo)致通路內(nèi)一系列激酶發(fā)生級(jí)聯(lián)磷酸化,最終導(dǎo)致下游YAP蛋白的磷酸化,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖。TANG等[24]研究報(bào)道抑制Hippo通路中YAP蛋白的激活,能明顯抑制胃癌細(xì)胞的線粒體功能,阻斷腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化所需的能量代謝過程,降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。CHEN等[25]研究證實(shí)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的LATS1基因發(fā)生去甲基化能夠阻止YAP信號(hào)入核,下調(diào)腫瘤生長與侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,抑制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,與正常組相比,組胺低、中、高劑量組細(xì)胞LATS1基因甲基化比例及YAP1、p-YAP1表達(dá)均明顯下降,LATS1表達(dá)明顯升高。說明組胺對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的作用是通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

    綜合上述,組胺能抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的體外增殖與侵襲能力,降低其線粒體膜電位,使腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長明顯受限,這可能是通過調(diào)控Hippo-YAP信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。組胺如何通過改善鼻咽癌患者免疫功能發(fā)揮綜合抗瘤功效將是下一步的研究重點(diǎn)。

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