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    南蛇藤素通過調控M2型巨噬細胞極化提高A549細胞對順鉑的敏感性①

    2022-11-15 09:03:04車成日林星延邊大學醫(yī)學院延吉133002
    中國免疫學雜志 2022年17期
    關鍵詞:極化敏感性肺癌

    于 博 車成日 林星(延邊大學醫(yī)學院,延吉 133002)

    肺癌是全球最常見癌癥之一,且致死率最高。每年新增確診患者約180萬,死亡人數(shù)達160萬。盡管肺癌治療方法不斷更新,但由于其高轉移性及原發(fā)性或獲得性耐藥,肺癌患者五年生存率僅為15%左右[1-2]。腫瘤微環(huán)境是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。腫瘤微環(huán)境中眾多的浸潤炎癥細胞中,腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)最為豐富,占總數(shù)的30%~50%。惡性腫瘤中的TAMs傾向于M2型極化,從而抑制抗腫瘤免疫應答,促進腫瘤侵襲遷移[3-4]。南蛇藤素(celastrol,CEL)是一種提取于傳統(tǒng)中藥雷公藤根部的天然五環(huán)三萜類化合物,具有抗炎、抗氧化等藥理作用[5]。研究表明CEL能夠通過多種信號通路抑制胰腺癌和肺癌增殖、黏附、侵襲、遷移等[6-7]。但CEL是否可通過調控TAMs極化影響肺癌化療敏感性有待進一步研究。本研究旨在探討CEL通過影響M2型巨噬細胞極化提高人肺癌細胞A549對順鉑敏感性的作用及可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料人肺癌細胞株A549、巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院細胞庫;CEL購自上海源葉生物科技有限公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自索萊寶;Easy Pure Viral DNA/RNA Kit購自Transgen Biotech;LY-294002購自貝博生物有限公司;CD163(93498)、p-PI3K(64326)、PI3K(2537)、

    p-AKT(5831)、AKT(53270)、Bcl2(15071)、Bax(5023)和GAPDH(5174)抗體購自Cell Signaling Technology;電泳儀及電泳槽購自美國E-C Apparatus Corporation;全波長酶標儀、Western blot轉膜儀和Gel Doc凝膠成像儀購自美國Bio-Rad。

    1.2 方法

    1.2.1 CCK-8增殖實驗取對數(shù)生長期RAW264.7細胞和A549細胞,以2×104個/孔接種于96孔板,細胞生長至70%左右融合時,加入不同濃度CEL(0、10、20、40、80、100 nmol/L),24 h后10μl/孔加入CCK-8試劑,2 h后測定450 nm處吸光度(OD)。

    1.2.2 巨噬細胞M2型極化誘導取對數(shù)生長期RAW264.7細胞接種于培養(yǎng)皿,加入IL-4/IL-13(20 ng/ml)處理48 h誘導M2極化,qRT-PCR和細胞免疫熒光實驗檢測M2型巨噬細胞標志物表達。

    1.2.3 qRT-PCR RAW264.7經(jīng)極化誘導后,給予40 nmol/L CEL處理24 h,收集并純化所有RNA,合成cDNA,采用Bio-Rad SYBR Premix進行qRT-PCR分析。MRC1、Arg1、Actin的鼠引物序列見表1,以Actin為內參。PCR循環(huán)條件:95℃預變性30 s,95℃5 s,60℃30 s,共40個循環(huán)。

    表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

    1.2.4 細胞免疫熒光實驗RAW264.7細胞接種于6孔板,經(jīng)IL-4/IL-13誘導極化后,給予40 nmol/L CEL處理24 h,4%多聚甲醛固定30 min,3%Triton-X 100孵 育10 min,5%BSA封 閉,加 入CD163抗 體(1∶100)孵育2 h,PBS清洗,加入FITC標記的熒光二抗(1∶500)室溫孵育1 h,含DAPI封片液封片,熒光顯微鏡拍照。

    1.2.5 Western blot收集細胞碎片進行裂解,每孔30μg蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳(120 V,90 min),根據(jù)分子量分離蛋白,轉至PVDF膜(300 mA,60 min),5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉2 h,分別加入抗體p-PI3K(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、AKT(1∶2 000)、Bcl-2(1∶3 000)、Bax(1∶2 000)和GAPDH(1∶3 000)室溫孵育2 h,TBST清洗3次,加入HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗(1∶8 000)室溫孵育2 h,凝膠成像系統(tǒng)拍照。

    1.2.6 CEL對A549細胞順鉑敏感性的影響將A549細胞分為對照組、CEL組、M2組(A549細胞與M2型巨噬細胞共培養(yǎng))、M2+CEL組(A549細胞與CEL處理的M2型巨噬細胞共培養(yǎng))和M2+LY-294002組(A549細胞與LY-294002處理的M2型巨噬細胞共培養(yǎng)),將不同組A549細胞接種于96孔板,80μmol/L順鉑處理24 h,CCK-8檢測細胞活性。

    1.3 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 CEL對RAW264.7細胞和A549細胞活性的影響當CEL達到80 nmol/L時抑制RAW264.7細胞活性,但對A549細胞活性無影響(圖1)。因此,為排除CEL對RAW264.7細胞活性的影響,選擇40 nmol/L進行后續(xù)實驗。

    圖1 CEL對RAW264.7細胞和A549細胞活性的影響Fig.1 Effect of CEL on cell viabilities of RAW264.7 and A549 cells

    2.2 CEL對RAW264.7細胞M2型標志物MRC1和Arg1 mRNA水平的影響與對照組相比,IL-4/13組RAW264.7細胞MRC1和Arg1 mRNA水平 明 顯升高,與IL-4/13組相比,CEL組RAW264.7細胞MRC1和Arg1 mRNA水平顯著降低(圖2)。

    圖2 CEL對RAW264.7細胞M2型標志物MRC1和Arg1 mRNA水平的影響Fig.2 Effect of CEL on mRNA expressions of M2-type markers MRC1 and Arg1 of RAW264.7 cells

    2.3 CEL對RAW264.7細胞M2型標志物CD163蛋白表達的影響免疫熒光檢測CD163表達,結果表明,IL-4/13組RAW264.7細胞CD163表達明顯高于對照組,而CEL處理后,細胞CD163表達低于IL-4/13組(圖3)。

    圖3 CEL對RAW264.7細胞M2型標 志物CD163蛋白表達的影響Fig.3 Effect of CEL on M2-type marker CD163 protein expression in RAW264.7 cells

    2.4 CEL對RAW264.7細 胞PI3K/AKT的 影 響Western blot檢測PI3K/AKT蛋白表達,結果顯示,IL-4/13組RAW264.7細 胞p-PI3K和p-AKT表 達 明顯高于對照組,而加入CEL后p-PI3K和p-AKT表達下降,表明CEL能夠抑制M2型巨噬細胞PI3K/AKT信號通路(圖4A)。為進一步探討CEL是否通過PI3K/AKT信號通路抑制M2型極化,M2型巨噬細胞中加入LY-294002阻滯PI3K/AKT信號通路,qRTPCR檢 測MRC1和Arg1水 平,結 果 與CEL作 用 類似,LY-294002也能抑制MRC1和Arg1 mRNA表達(圖4B)。

    圖4 CEL對RAW264.7細胞PI3K/AKT的影響Fig.4 Effect of CEL on PI3K/AKT of RAW264.7 cells

    2.5 CEL對A549細胞順鉑敏感性的影響IL-4/13組細胞活性明顯高于對照組,而加入CEL或LY-294002后,IL-4/13組細胞活性明顯降低,表明CEL能夠增強A549細胞對順鉑的化療敏感性(圖5)。

    圖5 CEL對A549細胞順鉑敏感性的影響Fig.5 Effect of CEL on cisplatin sensitivity of A549 cells

    2.6 CEL對順鉑誘導的A549細胞凋亡的影響A549細胞與M2型巨噬細胞共培養(yǎng)后,分別加入40 nmol/L CEL和10μmol/L LY-294002,24 h后給予10μmol/L順鉑孵育24 h,收集細胞提取蛋白,Western blot檢測細胞Bcl-2和Bax蛋白表達,結果顯示,與對照組比較,IL-4/13組細胞Bcl-2表達升高而Bax表達下降,與IL-4/13組相比,CEL和LY-294002處理后Bcl-2表達下降而Bax表達升高(P<0.01,圖6)。表明CEL可促進順鉑誘導的A549細胞凋亡。

    圖6 CEL對順鉑誘導的A549細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of CEL on cisplatin-induced apoptosis in A549 cells

    3 討論

    肺癌臨床治療仍以手術治療和化療為主要方案,原發(fā)性或獲得性耐藥是肺癌患者治療失敗和復發(fā)的主要原因之一。由于標準抗癌療法療效較差及副作用嚴重,天然藥物成為新的研究熱點。大量研究表明,CEL在體內外均具有較強的抗腫瘤活性。但相關研究通常強調CEL對腫瘤細胞增殖和凋亡的直接影響,關于CEL是否可影響腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞極化從而影響肺癌細胞化療敏感性的研究尚未見報道。

    腫瘤進展伴隨微環(huán)境改變。TAMs是腫瘤微環(huán)境的重要組成,也是腫瘤進展的主要原因。研究表明,M2型巨噬細胞具有抗炎、抗腫瘤、促進腫瘤免疫逃逸等作用[8]。因此,調節(jié)M2型TAMs可能是腫瘤治療的潛在方法。CEL能夠通過阻滯M2型巨噬細胞極化抑制小鼠乳腺癌細胞4T1肺轉移。本研究同樣發(fā)現(xiàn),40 nmol/L CEL能夠明顯抑制M2型巨噬細胞標志物mRNA和蛋白表達。

    越來越多研究表明多種細胞信號通路參與巨噬細胞表型轉化。因此,本研究進一步探索了CEL抑制M2型巨噬細胞極化的潛在機制。ZHAO等[9]表明巨噬細胞清道夫受體1通過激活PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin通路促進M2型極化。此外,ZHU等[10]報道CEL通過阻斷PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制膠質瘤血管模擬形成和血管生成。本研究顯示,CEL顯著降低M2型巨噬細胞p-PI3K和p-AKT水平,且CEL與LY-294002均能抑制M2型巨噬細胞標志 物MRC1和Arg1 mRNA表達,表明CEL通過PI3K/AKT信號通路抑制巨噬細胞M2型極化。

    順鉑是肺癌的主要化療藥物之一,通過誘導DNA損傷和凋亡抑制腫瘤生長,但順鉑耐藥已成為高效治療的主要障礙[11-12]。WEI等[13]研究表明,M2型巨噬細胞能夠促進肺癌細胞對5-氟尿嘧啶耐藥。因此,基于CEL對M2型巨噬細胞極化的調節(jié)作用,課題組進一步研究了CEL對A549順鉑敏感性的作用,結果表明CEL能夠抑制M2型巨噬細胞誘導的A549細胞對順鉑的耐藥性,且LY-294002與CEL作用相同。

    綜上所述,CEL通過PI3K/AKT信號通路抑制M2型巨噬細胞極化,從而提高A549細胞對順鉑的敏感性。

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