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    紅景天苷對腎癌細胞A498侵襲、免疫炎癥因子及ERK1/2和STAT3活化的影響

    2022-11-15 09:03:02薛智淞四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院四川省人民醫(yī)院成都610000
    中國免疫學(xué)雜志 2022年17期
    關(guān)鍵詞:腎癌癌細胞孵育

    趙 丹 楊 祺 竇 科 薛智淞(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,四川省人民醫(yī)院,成都 610000)

    腎癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,病因尚不明確,可能與遺傳、吸煙、肥胖等因素有關(guān)[1]。腎癌患者早期一般無明顯癥狀,臨床主要采用手術(shù)切除治療,但尚缺乏有效的輔助治療方案來預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2]。腎癌晚期患者可表現(xiàn)腰痛、血尿、貧血、體重減輕等,臨床主要采用以內(nèi)科治療為主的綜合治療措施,但晚期癌細胞對大多治療藥物的敏感性較低,預(yù)后較差[3]。尋找敏感的腎癌治療藥物,輔助臨床治療,降低術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移,受到了研究者們的廣泛關(guān)注。紅景天(Rhodiola rosea)是我國傳統(tǒng)中藥的重要組成部分,紅景天苷(salidroside,SAL)是紅景天的主要活性成分,具有抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、減輕化療毒性等多種藥理學(xué)作用,已廣泛應(yīng)用于臨床心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、抗腫瘤等領(lǐng)域[4]。既往研究顯示,SAL可以抑制胃癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤細胞的增殖活性,發(fā)揮抗腫瘤作用,但其對腎癌細胞的作用尚不明確,具體作用機制尚不清楚[5-7]。因此,本研究探討了SAL對腎癌細胞A498增殖、運動和免疫的影響,并進一步分析了其可能的作用機制,旨在為腎癌的治療提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料倒置顯微鏡(CKX41-A32PH)、熒光顯微鏡(BX-2)均購自日本Olympus公司;A498細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫;SAL購自中國藥品生物制品鑒定所,純度>99%;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8檢測試劑盒、Transwell小室(包被Matrigel基底膜)均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司;IL-6、IL-10和TNF-α均購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司;辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、β-actin單克隆抗體、兔抗人上皮細胞鈣黏素(epithelial cadherin,E-cad)、神經(jīng)鈣黏素(nerve cadherin,N-cad)、波形蛋白(Vimentin)、IL-10、TNF-α、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、p-ERK1/2(Thr202/Tyr204位點)、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transduction and transcriptional activators 3,STAT3)、p-STAT3(Ser727位點)均購自美國CST公司。

    1.2 方法

    1.2.1 SAL劑量的篩選采用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A498細胞,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,隔天換液。取對數(shù)生長期細胞以1×105個/ml接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,分別于不同濃度的SAL(終濃度分別為0、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320μmol/L)孵育48 h,進行CCK-8檢測,檢測570 nm波長下各孔的吸光度值,計算細胞存活率,根據(jù)SAL作用濃度增殖曲線,計算半抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50),設(shè)置SAL 0μmol/L組、SAL 10μmol/L組、SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組。

    1.2.2 Transwell檢測A498細胞侵襲取各組與SAL孵育24 h的A498細胞,取100μl細胞以5×104個/孔加于Transwell上室(上室添加無血清的培養(yǎng)基,下室添加正常的培養(yǎng)液),培養(yǎng)24 h后,取出Transwell小室,采用質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛的進行固定,質(zhì)量分數(shù)為0.1%結(jié)晶紫的進行染色,顯微鏡下計數(shù)膜下室面表面細胞。

    1.2.3 顯微鏡下觀察A498細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)取各組與SAL孵育24 h的A498細胞,正常培養(yǎng)5 d后,倒置于顯微鏡下,觀察各組細胞形態(tài)的變化,是否發(fā)生EMT。

    1.2.4 ELISA法檢測細胞上清液中免疫炎癥因子水平取各組與SAL孵育24 h的A498細胞,離心(1 000 g,2 min),取上清,采用ELISA法檢測細胞上清液中IL-6、IL-10和TNF-α水平,嚴(yán)格按試劑盒說明操作。

    1.2.5 Western blot檢 測E-cad、N-cad、Vimentin、IL-10、TNF-α、ERK1/2和STAT3蛋白表達取各組與SAL孵育24 h的A498細胞,提取各組細胞的總蛋白并進行蛋白定量,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)PVDF膜,脫脂牛奶封閉2 h,加一抗E-cad、N-cad、Vimentin、IL-10、TNF-α、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3(稀釋比例均為1∶1 000),以β-actin(1∶500)作為內(nèi)參,4℃孵育過夜,加HRP標(biāo)記的IgG(1∶5 000),室溫下孵育2 h,電化學(xué)發(fā)光顯影,凝膠圖像處理系統(tǒng)分析各蛋白相對內(nèi)參表達量。

    1.2.6 免疫熒光檢測ERK1/2的細胞核轉(zhuǎn)位取各組與SAL孵育24 h的A498細胞,以5×104個/孔接種于24孔培養(yǎng)板,每孔加入200μl固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1),于4℃冰箱固定15 min,加含0.1%Triton X-100的PBS作用5 min,用含10%正常羊血清的PBS封閉30 min,加一抗p-ERK1/2(1∶100),4℃孵育過夜,加FITC標(biāo)記的二抗(1∶100),37℃孵育1 h,熒光顯微鏡觀察計數(shù)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS22.0分析實驗數(shù)據(jù),滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料均以±s表示,采用單因素方差分析組間差異性,SNK-q檢驗比較組內(nèi)兩組間差異,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SAL抑制A498細胞增殖CCK-8實驗結(jié)果顯示(圖1),SAL對A498細胞的抑制作用呈藥物濃度依賴性,IC50(23.41±2.45)μmol/L,因此設(shè)置SAL 0μmol/L組、SAL 10μmol/L組、SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組。隨著SAL濃度升高,A498細胞的存活率降低(P<0.05)。

    圖1 SAL抑制A498細胞增殖Fig.1 SAL inhibits proliferation of A498 cells

    2.2 SAL抑制A498細胞侵襲Transwell實驗結(jié)果顯示(圖2),隨著SAL濃度升高,A498侵襲細胞數(shù)減少(P<0.05)。

    圖2 SAL抑制A498細胞侵襲Fig.2 SAL inhibits A498 cell invasion

    2.3 SAL抑制A498細胞EMT及相關(guān)蛋白表達顯微鏡觀察結(jié)果顯示(圖3A),SAL 0μmol/L組和SAL 10μmol/L組細胞排列相對較疏松,部分細胞拉長呈梭形,SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組細胞排列相對密集,細胞核皺縮變小。Western blot檢測結(jié)果顯示(圖3B),隨著SAL濃度升高,A498細胞E-cad蛋白表達升高,N-cad和Vimentin蛋白表達降低(P<0.05)。

    圖3 SAL抑制A498細胞EMT及相關(guān)蛋白表達Fig.3 SAL inhibited expression of EMT and related proteins in A498 cells

    2.4 SAL抑制A498細胞免疫炎癥因子表達ELISA檢測結(jié)果顯示(圖4A),隨著SAL濃度升高,A498細胞上清中IL-6和TNF-α水平下降,IL-10水平升高(P<0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示(圖4B),隨著SAL濃度升高,A498細胞TNF-α蛋白表達下降,IL-10蛋白表達升高(P<0.05)。

    圖4 SAL抑制A498細胞免疫炎癥因子表達Fig.4 SAL inhibited expression of immune inflammatory cytokines in A498 cells

    2.5 SAL抑 制A498細 胞ERK1/2和STAT3的 活化Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示(圖5),隨著SAL濃 度 升 高,A498細 胞p-ERK1/2/ERK1/2和p-STAT3/STAT3蛋白表達降低(P<0.05)。

    圖5 SAL抑制A498細胞ERK1/2和STAT3的活化Fig.5 SAL inhibits activation of ERK1/2 and STAT3 in A498 cells

    3 討論

    腎癌早期無典型癥狀,初診時往往已發(fā)展至晚期,預(yù)后較差,臨床尚缺乏治療的特效藥物。中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分,資源豐富,歷史悠久,近年來有研究從傳統(tǒng)中藥中篩選出了多種具有抗癌活性的藥物,并將其應(yīng)用于臨床,取得了一定的療效[8]。SAL是紅景天的主要活性成分,可以抑制多種腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為,但其具體作用機制尚不清楚[9]。本研究探討了SAL對腎癌細胞A498增殖的影響,發(fā)現(xiàn)SAL對腎癌細胞A498增殖的抑制作用呈藥物濃度依賴性,且隨著SAL濃度升高,細胞存活率下降,提示SAL以藥物濃度依賴性的方式抑制腎癌細胞增殖,發(fā)揮抗腫瘤作用。

    本研究中,SAL 20μmol/L組和SAL 40μmol/L組A498細胞排列緊密,侵襲細胞數(shù)明顯低于SAL 0μmol/L組,且隨著SAL濃度升高,E-cad蛋白表達升高,N-cad和Vimentin蛋白表達下降。E-cad是一種鈣依賴性的上皮性標(biāo)記蛋白,主要分布于上皮組織,可以介導(dǎo)細胞間的黏附作用,其表達降低或缺失可以使細胞間黏附力降低,促進腫瘤細胞發(fā)生EMT[10]。N-cad與E-cad的作用相反,N-cad高表達可以促進癌細胞的黏附和遷移,促進腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[11]。Vimentin屬于中間絲蛋白家族,主要表達于間充質(zhì)細胞,是細胞骨架的組成成分,可以調(diào)節(jié)細胞的黏附功能,其表達陽性是腫瘤細胞發(fā)生EMT的標(biāo)志[12]。已有研究顯示,EMT是腫瘤細胞脫離原發(fā)病灶向周圍或遠處組織擴散的基礎(chǔ),在腫瘤的侵襲、遷移過程中發(fā)揮重要的作用,提示SAL可以調(diào)節(jié)腫瘤EMT相關(guān)蛋白表達,抑制腫瘤細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)換,抑制腫瘤細胞的侵襲[13]。腫瘤細胞的侵襲是癌細胞轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ),也是影響患者預(yù)后死亡的主要因素,提示SAL可以抑制腎癌細胞的轉(zhuǎn)移,改善患者預(yù)后[14]。

    本研究中,隨著SAL濃度升高,細胞IL-6和TNF-α水平降低,IL-10水平升高。IL-6是一種多功能的免疫炎癥因子,可以刺激B細胞活化,調(diào)節(jié)腫瘤細胞的免疫逃逸,還可以誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)釋放,促進腫瘤血管生成,促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[15]。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生,可以激活炎癥信號通路,誘導(dǎo)IL-6表達,還可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、血管生成等,參與腫瘤的惡性進展[16]。IL-10是細胞內(nèi)重要的免疫炎癥抑制因子,可以抑制IL-6、TNF-α的合成和分泌[17]。既往研究顯示,TNF-α還可以參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的ERK1/2、JAK/STAT、NF-κB等信號通路,參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞惡性生物學(xué)行為,介導(dǎo)腫瘤的惡性進展[18-19]。LI等[20]研究顯示,SAL具有抗炎作用,可以抑制MAPK和NF-κB信號通路,抑制TNF-α誘導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng),提示SAL可以抑制免疫炎癥因子IL-6和TNF-α表達,抑制腎癌細胞的惡性生物學(xué)行為。

    本研究中,隨著SAL濃度升高,細胞p-ERK1/2/ERK1/2和p-STAT3/STAT3蛋白表達降低。ERK1/2是一種細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶,屬于MAPK家族,可以將細胞外信號從表面受體傳導(dǎo)至細胞核,調(diào)節(jié)腫瘤細胞的惡性增殖和運動[21]。STAT3屬于STAT家族,可以與酪氨酸激酶(tyrosine kinas,JAK)組成JAK/STAT信號通路,參與細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo),調(diào)控腫瘤的炎癥、增殖和侵襲[22]。STAT3是ERK1/2的底物之一,ERK1/2磷酸化和核轉(zhuǎn)位可以激活STAT3,調(diào)節(jié)腫瘤細胞的免疫炎癥反應(yīng),促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、EMT等過程[23-24]。LV等[25]的研究顯示,SAL可以抑制STAT3的表達,抑制腎癌細胞的增殖,提示SAL可能通過抑制ERK1/2和STAT3的磷酸化,調(diào)控腎癌細胞的惡性生物學(xué)行為。

    綜上所述,SAL可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞免疫炎癥因子表達,抑制腎癌細胞A498的增殖、侵襲和EMT,其作用機制可能與抑制ERK1/2和STAT3的磷酸化有關(guān)。但本研究僅探討了SAL對腎癌細胞的作用及可能的機制,尚需大量的臨床前研究來驗證。

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