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    BBOX1-AS1被TFAP4激活從而促進胃癌細胞的增殖和遷移

    2022-11-15 09:03:02馬雨凡嚴永峰張亞軍涼山州第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科西昌615000
    中國免疫學雜志 2022年17期
    關鍵詞:熒光素酶細胞系試劑盒

    張 琴 馬雨凡 嚴永峰 張 璐 張亞軍(涼山州第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科,西昌 615000)

    胃癌是消化道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,2017年全球累計新增122.1萬胃癌患者,86.5萬人因胃癌死亡,是癌癥相關死亡的第二大原因[1-2]。目前,胃癌的主要治療手段以手術切除和化療為主[3]。但胃癌患者的預后依舊很差,并存在復發(fā)和轉移現(xiàn)象。因此,深入闡明胃癌的發(fā)生發(fā)展機制,尋找新的治療策略以改善胃癌患者的治療和預后具有深刻意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,并可作為多種癌癥的潛在治療靶點[4-6]。BBOX1-AS1是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,研究發(fā)現(xiàn)其能夠海綿吸附miR-361-3p促進宮頸癌和結腸癌的發(fā)生發(fā)展[7-8];卵巢癌中BBOX1-AS1吸附miR-361-3p可上調(diào)PODXL表達,促進卵巢癌的發(fā)生發(fā)展[9]。但關于BBOX1-AS1在胃癌中的功能和分子機制尚不明確,因此,本研究深入探討其在胃癌中的分子功能和作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗細胞人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1及胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,并在本實驗室傳代培養(yǎng)。

    1.1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司;青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶購自武漢普諾賽生命科技有限公司;RIPA細胞裂解液、Trizol裂解液、Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;cDNA反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司;TFAP4過表達載體(oe-TFAP4)、TFAP4干擾序列(si-TFAP4)、BBOX1-AS1干擾序列(si-BBOX1-AS1)及其陰性對照載體(oe-NC、si-NC)、BBOX1-AS1野生型和突變型熒光素酶載體均由上海吉瑪生物有限公司構建合成;CCK-8試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司;TFAP4、MMP-2、MMP-9及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG和兔抗GAPDH單克隆抗體購自美國Abcam公司;ECL試劑盒購自中國Solarbio公司。干擾序列如下:si-TFAP4-5'-CAGGAAAACAGAGAAAGAAGTGA-3';si-BBOX1-AS1#1-5'-TGGTTCTAAAATCTAAAAGAAGA-3';si-BBOX1-AS1#2-5'-GAGCTATTCCATGTATTCCATGG-3'。

    1.2 方法

    1.2.1 GEPIA2數(shù)據(jù)庫在線分析通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫Expression DIY模塊(http://gepia2.cancer-pku.cn/#analysis)以ANOVA為 分 析 方 法,|log2FC|>1,q-value<0.01為閾值,在線分析BBOX1-AS1在胃癌患者中的表達水平。

    1.2.2 細胞培養(yǎng)將人正常胃黏膜上皮細胞系GES-1及胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45培養(yǎng)于含10%(V/V)胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,在37℃、含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,進行后續(xù)研究。

    1.2.3 細胞轉染取對數(shù)生長期的MKN45細胞,以0.8×106個/孔接種于6孔板,待細胞密度達到60%時,根據(jù)參考說明書使用Lipofectamine 3000轉染siRNA、重組載體和各自對照至MKN45細胞中。

    1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)按照試劑盒說明書方案使用Trizol裂解液從細胞中提取總RNA,試劑盒反轉錄合成cDNA。SYBR熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR實驗。以GAPDH為內(nèi)參進行歸一化處理,結果用2-ΔΔCt值比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量差異。BBOX1-AS1正向引 物:5'-TGTGTGTTTCCTGAGGCCTC-3';反 向 引物:5'-CGCCTCTCTTGGAACACCTT-3';GAPDH正向引物:5'-CCACAGTCCATGCCATCAC-3';反 向 引物:5'-CGTTCAGCTCAGGGATGAC-3'。

    1.2.5 Western blot收集各處理組細胞,用預冷的RIPA裂解液冰上裂解10 min后提取細胞總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量后,將等量蛋白于100 V下進行SDS-PAGE分離蛋白。之后以60 V、120 min將蛋白遷移至NC膜,一抗4℃孵育過夜,加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗,室溫下孵育120 min,然后用ECL試劑盒進行發(fā)光反應,拍照觀察蛋白印記。

    1.2.6 JASPAR預測BBOX1-AS1和轉錄因子TFAP4的結合位點利用JASPAR數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net/search?advanced=true)查詢轉錄因子TFAP4的信息,并導入BBOX1-AS1啟動子區(qū)序列信息,網(wǎng)站在線預測TFAP4和BBOX1-AS1啟動子的結合位點。

    1.2.7 熒光素酶實驗利用Lipofectamine 3000分別將si-TRAP4、si-NC、oe-TRAP4、oe-NC和BBOX1-AS1野生型和突變型熒光素酶載體共轉染至MKN45細胞,轉染48 h后采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光素酶活性。

    1.2.8 CCK-8實驗將MKN45細胞以1×104個/孔接種于96孔板,分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后,加入CCK-8溶液繼續(xù)孵育4 h。酶標儀檢測450 nm處的吸光度,測定細胞活力。

    1.2.9 劃痕實驗將MKN45細胞以5×105個/孔接種于6孔板,當細胞密度達到80%后,用移液器槍頭在6孔板上輕輕劃過,PBS洗滌細胞3次,去除游離細胞。加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,顯微鏡下觀察并拍照,記錄0 h和24 h的細胞遷移情況。

    1.3 統(tǒng)計學分析所有實驗均進行3次平行實驗,并采用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計學分析,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 BBOX1-AS1在胃癌組織及細胞系中高表達 GEPIA2數(shù)據(jù)庫在線分析顯示BBOX1-AS1在胃癌組織中高表達(圖1A,P<0.05),但其表達水平和胃癌患者預后關系不明顯(圖1B,P>0.05);qRT-PCR結果顯示,與正常胃黏膜上皮細胞系GES-1相比,BBOX1-AS1在胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45中均顯著高表達(P<0.001,圖1C)。BBOX1-AS1在MKN45細胞系中表達水平最高,因此選擇MKN45細胞系進行下一步研究。

    圖1 BBOX1-AS1在胃癌組織及細胞系中的表達情況Fig.1 Expression of BBOX1-AS1 in gastric cancer tissues and cell lines

    2.2 TFAP4調(diào)控BBOX1-AS1表達Western blot結果顯示,相較于GES-1細胞,TFAP4在胃癌細胞系AGS、HGC27、MKN45中表達均顯著上調(diào)(P<0.001,圖2A)。分別轉染TFAP4過表達載體(TFAP4過表達組)、TFAP4干擾序列(TFAP4抑制組)及其陰性對照至MKN45細胞。Western blot檢測TFAP4表達水平,結果表明,與si-NC組相比,TFAP4抑制組TFAP4表達水平顯著降低(P<0.001,圖2B);與oe-NC組相比,TFAP4過表達組TFAP4表達水平顯著增加(P<0.01,圖2B)。此外,qRT-PCR結果顯示,與si-NC組相比,TFAP4抑制組BBOX1-AS1表達水平顯著降低(P<0.01,圖2C);與oe-NC組相比,TFAP4過表達組BBOX1-AS1表達水平顯著升高(P<0.001,圖2C)。以上研究表明TFAP4可能調(diào)控BBOX1-AS1的表達。

    圖2 TFAP4參與調(diào)控BBOX1-AS1表達Fig.2 TFAP4 is involved in regulating expression of BBOX1-AS1

    2.3 TFAP4激 活BBOX1-AS1轉 錄JASPAR數(shù) 據(jù)庫在線分析發(fā)現(xiàn)TFAP4能夠與BBOX1-AS1啟動子區(qū)724~733位點結合(圖3A)。GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析顯示,TFAP4在胃癌組中高表達(P<0.05,圖3B),但其與患者預后關系不明顯(P>0.05,圖3C);熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)在BBOX1-AS1啟動子野生型中,過表達TFAP4能夠增強熒光素酶活性,而抑制TFAP4則減弱熒光素酶活性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001,圖3D);在BBOX1-AS1啟動子突變組(5'-ATCCGCTGTTCC-3'→5'-GGATAACGAA-3')中則無上述現(xiàn)象。提示TFAP4和BBOX1-AS1啟動子區(qū)724~733位點結合并激活BBOX1-AS1轉錄。

    圖3 TFAP4激活BBOX1-AS1轉錄Fig.3 TFAP4 activates transcription of BBOX1-AS1

    2.4 抑制BBOX1-AS1表達可抑制胃癌細胞增殖qRT-PCR檢測BBOX1-AS1的干擾效率,結果表明,與si-NC組 相 比,si-BBOX1-AS1#1、2組 中BBOX1-AS1表 達 水 平 均 顯 著 降 低(P<0.001,圖4A),其中si-BBOX1-AS1#1的表達水平更低,因此選擇si-BBOX1-AS1#1進行下一步研究。CCK-8和EDU實驗結果顯示,與si-NC組相比,si-BBOX1-AS1#1組MKN45細胞增殖能力顯著降低(P<0.001,圖4B、C)。提示抑制BBOX1-AS1表達能夠抑制胃癌細胞增殖。

    圖4 抑制BBOX1-AS1表達對胃癌細胞增殖的影響Fig.4 Effect of inhibiting BBOX1-AS1 expression on proliferation of gastric cancer cells

    2.5 干擾BBOX1-AS1表達可抑制胃癌細胞遷移劃痕實驗結果顯示,與si-NC組相比,si-BBOX1-AS1#1組細胞遷移能力顯著降低(P<0.001,圖5A)。Western blot結果顯示,與si-NC組相比,si-BBOX1-AS1#1組MNK45細胞MMP-2、MMP-9表達水平顯著降低(P<0.001,P<0.01,圖5B)。提示干擾BBOX1-AS1表達能夠抑制胃癌細胞的遷移。

    圖5 抑制BBOX1-AS1表達對胃癌細胞遷移的影響Fig.5 Effect of inhibiting BBOX1-AS1 expression on migration of gastric cancer cells

    3 討論

    胃癌是世界范圍內(nèi)嚴重的衛(wèi)生健康問題,嚴重威脅人類的生命安全。胃癌患者常在晚期才被診斷出來,導致胃癌患者的治療效果不甚理想[10]。最近多項研究表明lncRNA在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]。lncRNA MAGI2-AS3受BRD4調(diào)控,通過海綿吸附miR-141/200a促進ZEB1過表達,進而促進胃癌進展[12];lncRNA AC093818.1通過表觀遺傳學促進PDK1表達,加速胃癌轉移[13];BBOX1-AS1在宮頸癌、結腸癌、卵巢癌等癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,并可作為結直腸癌的預后標志物[14],但關于其在胃癌中的研究還尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)BBOX1-AS1在胃癌組織和細胞系中高表達。此外,在胃癌中TFAP4也是重要因子[15]。研究發(fā)現(xiàn)TFAP4在胃癌中也高表達。

    TFAP4是一個轉錄因子,在多數(shù)惡性腫瘤中異常表達,和腫瘤浸潤程度顯著相關,并與腫瘤患者的不良預后顯著相關[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)TFAP4在肝癌中激活Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路促進腫瘤惡性進展[18-19]。并且有研究發(fā)現(xiàn)TFAP4能轉錄激活lncRNA表達,進而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展,如:TFAP4與LASP1和LINC00520的啟動子區(qū)結合,轉錄激活LASP1和LINC00520表達,促進膠質(zhì)瘤惡性進展[20];TFAP4能夠與lncRNA TRERNA1啟動子中的E-box基序結合并激活其轉錄,進而促進胃癌細胞的遷移和侵襲[21]。此外miR-608通過抑制TFAP4促進阿霉素誘導的非小細胞肺癌細胞凋亡[22];miR-302C靶向TFAP4抑制結直腸癌上皮-間充質(zhì)轉化和轉移[23]。以上研究表明,TFAP4能夠調(diào)控lncRNA促進腫瘤惡性進展,且TFAP4能夠作為腫瘤治療的潛在靶標。本研究發(fā)現(xiàn),TFAP4過表達能夠上調(diào)BBOX1-AS1表達,而抑制TFAP4表達可降低BBOX1-AS1表達。此外,JASPAR數(shù)據(jù)庫和熒光素酶實驗證實TFAP4能夠激活BBOX1-AS1轉錄,這與其既往研究結果一致[21]。最后課題組進一步探究BBOX1-AS1在MKN45細胞系中的分子功能,CCK-8和EDU實驗證實抑制BBOX1-AS1表達可抑制MKN45細胞增殖能力;劃痕實驗證實抑制BBOX1-AS1表達可抑制MKN45細胞遷移能力。

    綜上所述,BBOX1-AS1和TFAP4在胃癌中高表達,TFAP4可與BBOX1-AS1的啟動子區(qū)結合轉錄激活BBOX1-AS1表達,進而促進胃癌細胞的增殖和遷移。

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