miR-449a靶向調(diào)控外周血Toll樣受體5影響風(fēng)濕性心臟病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究①

李寶亮 蘇 華 李夢(mèng)嘉 耿麗娜 馬俊帥（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，張家口 075000）

風(fēng)濕性心臟病是唯一可預(yù)防的心血管疾病，最近幾十年來(lái)，全球風(fēng)濕性心臟病的負(fù)擔(dān)有所減輕，但中低收入國(guó)家的患病率和病死率仍然很高［1］。風(fēng)濕性心臟病每年影響超過(guò)3 000萬(wàn)人，且每年導(dǎo)致超過(guò)30萬(wàn)人死亡［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是單鏈內(nèi)源性非編碼小RNA（長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸）。miRNA通常與目標(biāo)信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合以抑制基因表達(dá)，它們涉及許多生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞分化、凋亡、增殖和侵襲［3］。先前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-449a在硅膠處理的小鼠肺組織中顯著下調(diào)，是自噬的重要調(diào)節(jié)劑，也是肺纖維化的新型內(nèi)源性抑制劑，miR-449a通過(guò)靶向Notch-1信號(hào)通路保護(hù)H9C2細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的損傷，包括細(xì)胞凋亡和壞死［4］。但是，人們對(duì)miR-449a在風(fēng)濕性心臟病中的表達(dá)模式和作用仍知之甚少。Toll樣受體5（Toll-like receptor 5，TLR5）在風(fēng)濕性心臟病進(jìn)展中起重要作用［5］。血小板特異性TLR5等TLR的存在與血管炎癥和/或心血管危險(xiǎn)因素有關(guān)［6］。然而miR-449a是否通過(guò)TLR5參與風(fēng)濕性心臟病的發(fā)生發(fā)展，目前仍不清楚。本研究通過(guò)功能獲得實(shí)驗(yàn)探索miR-449a在風(fēng)濕性心臟病中的作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑M199培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclon公司）；Lipofectamine2000試劑（美國(guó)賽默飛世爾公司）；miR-449a模擬物、模擬物陰性對(duì)照miR-NC、miR-449a抑制劑（anti-miR-449a）、抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、TLR5小干擾RNA（si-TLR5）、小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）、TLR5過(guò)表達(dá)載體（pcDNATLR5）、過(guò)表達(dá)空載對(duì)照（pcDNA）（上海吉瑪公司）；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）（美國(guó)Sigma公司）；磷脂酰結(jié)合蛋白V-FITC（AnnexinV-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）試劑盒（美國(guó)BD公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega）；TLR5抗體、細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67（nuclear associated antigen Ki67，Ki-67）抗體、活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved-caspase-3）抗體、磷酸化p65（p-p65）抗體、磷酸化IκBα（p-IκBα）抗體（英國(guó)Abcam公司）。

1.1.2 臨床組織標(biāo)本本研究獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。2016年6月至12月，在獲得所有受試者或監(jiān)護(hù)人的知情同意后，對(duì)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心胸外科住院治療的9例風(fēng)濕性心臟病患者和接受體檢的健康志愿者在內(nèi)的所有參與者展開實(shí)驗(yàn)。所有患者在本院進(jìn)行了病理學(xué)診斷，排除非風(fēng)濕性心臟病、自身免疫性、感染性疾病等疾病。取風(fēng)濕性心臟病患者和健康志愿者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血5 ml，使用檸檬酸鈉抗凝后，于-70℃冰箱保存，直至RNA和蛋白提取。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞的分離提取根據(jù)宋智鋼等［7］的報(bào)道進(jìn)行。風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞在含150 ml/L胎牛血清的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，按照miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-449a組（轉(zhuǎn)染miR-449a模擬物）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-TLR5組（轉(zhuǎn)染si-TLR5）、anti-miR-NC組（轉(zhuǎn)染antimiR-NC）、anti-miR-449a組（轉(zhuǎn)染miR-449a抑制劑）、miR-449a+pcDNA-NC組（共轉(zhuǎn)染miR-449a和pcDNA-NC）、miR-449a+pcDNA-TLR5組（共轉(zhuǎn)染miR-449a+pcDNA-TLR5）的分組，使用Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后進(jìn)行其他指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 RNA提取和qRT-PCR根據(jù)Trizol試劑的說(shuō)明，從風(fēng)濕性心臟病外周血和心肌細(xì)胞中提取總RNA，并將其存儲(chǔ)在液氮中。對(duì)于RNA定量，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定所有樣品在260 nm和280 nm處的吸光度值之比（A260/A280）。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green PCR Master Mix在Applied Biosystems AB7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。miR-449a、TLR5 mRNA引物（由上海生工公司合成）序列為miR-449a F：5′-TGCGGTGGCAGTGTATTGTTAGC-3′和R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；TLR5 F：5′-ATTCTTGCCCACCACAT-3′和R：5′-GGTTGTCAAGTCCGTAAA-3′；β肌動(dòng) 蛋 白（β-actin）F：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′和R：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′；U6 F：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′和R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。β-actin和U6表達(dá)水平分別用作內(nèi)源性對(duì)照，以分別標(biāo)準(zhǔn)化mRNA和miRNA的 表達(dá)，并 通過(guò)2-ΔΔCt法 定量 相 對(duì)表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定為了檢測(cè)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率，在特定處理后進(jìn)行MTT測(cè)定。將細(xì)胞接種到96孔板中，2×104個(gè)/孔。48 h后添加MTT溶液，每孔20μl，然后在37℃孵育4 h。除去上清液后，每孔加入200μl PMSO。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的吸光度，以實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度值之比（A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組）計(jì)算細(xì)胞存活率（%）。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定處理后，收集細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，然后進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。將每個(gè)樣品的細(xì)胞（1×106個(gè)）重新懸浮在結(jié)合緩沖液中，并通過(guò)AnnexinV-FITC/PI試 劑盒 用AnnexinV-FITC和PI染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行分析和定量。

1.2.5 Western blot為測(cè)定TLR5、Ki67、Cleavedcaspase-3、p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)，收集待測(cè)的樣本或細(xì)胞，在冰上，將其于RIPA緩沖液中裂解，并在4℃下以12 000 r/min離心10 min。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)喹啉酸測(cè)定蛋白濃度。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離出等量的蛋白（50μg），然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與含有0.05%Tween 20和5%脫脂乳的PBS孵育以阻斷非特異性結(jié)合，接著與相應(yīng)的一抗孵育，然后與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的IgG二抗孵育。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光液顯色顯影后，使用凝膠成像系統(tǒng)和Image LabTM軟件對(duì)條帶密度進(jìn)行定量分析。以β-actin為對(duì)照，分析TLR5、Ki67、Cleaved-caspase-3、p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因分析使用Starbase靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件選擇miR-449a的潛在靶基因，包括TLR5。為探究miR-449a是否靶向TLR5，將miR-449a結(jié)合位點(diǎn)的TLR5-3'UTR-野生型（WT）及突變型（MUT）序列克隆到pmirGLO雙熒光素酶載體中，并將該載體命名為TLR5-3'UTR-WT和TLR5-3'UTR-MUT。將風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞接種到24孔板中，然后與TLR5-3'UTR-WT或TLR5-3'UTRMUT和miR-449a模擬物或其對(duì)照miR-NC共轉(zhuǎn)染。按照試劑盒說(shuō)明書操作，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.7 ELISA測(cè)定炎癥因子的釋放為了測(cè)定炎癥因子IL-1β、TNF-α水平，收集待測(cè)的細(xì)胞上清，根據(jù)IL-1β、TNF-α試劑盒的說(shuō)明，檢測(cè)炎癥因子IL-1β、TNF-α的釋放。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 風(fēng)濕性心臟病患者外周血TLR5和miR-449a表達(dá)水平qRT-PCR和Western blot檢測(cè)風(fēng)濕性心臟病患者外周血中miR-449a和TLR5的表達(dá)（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者比較，風(fēng)濕性心臟病患者外周血中miR-449a的表達(dá)水平明顯降低，TLR5 mRNA和TLR5蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。2.2過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率和凋亡率的影響在風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-449a模擬物，qRT-PCR檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示（圖2A），轉(zhuǎn)染miR-449a模擬物后miR-449a的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞，說(shuō)明成功過(guò)表達(dá)miR-449a。Western blot、MTT和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明（圖2B～D、表1），與miR-NC組比較，miR-449a組風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞的Ki67蛋白表達(dá)水平明顯提高，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞存活率明顯增加，而凋亡率顯著減少（P＜0.05）。

表1 過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of overexpression of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

表1 過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.1 Effects of overexpression of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-449a t P Apoptosis rate（%）22.43±2.12 10.02±1.051）15.737 0.000

圖1 風(fēng)濕性心臟病患者外周血TLR5和miR-449a表達(dá)水平Fig.1 TLR5 and miR-449a expression levels in peripheral blood of patients with rheumatic heart disease

圖2 過(guò)表達(dá)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率和凋亡率的影響Fig.2 Effects of overexpression of miR-449a on survival rate and apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease

2.3 低表達(dá)TLR5對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率和凋亡率的影響將TLR5小干擾RNA si-TLR5轉(zhuǎn)染至風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），同轉(zhuǎn)染si-NC組比較，轉(zhuǎn)染si-TLR5顯著降低TLR5蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），提示成功低表達(dá)TLR5。Western blot、MTT和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明（圖3、表2），與si-NC組比較，si-TLR5組明顯提高風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞的Ki67蛋白表達(dá)水平，顯著降低Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平，明顯增加細(xì)胞存活率，并顯著降低凋亡率（P＜0.05）。

表2 低表達(dá)TLR5對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of low expression of TLR5 on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

表2 低表達(dá)TLR5對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.2 Effects of low expression of TLR5 on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

Note：Compared with si-NC，1）P＜0.05.

Groups si-NC si-TLR5 t P Apoptosis rate（%）23.01±2.27 12.63±1.141）12.259 0.000

圖3 低表達(dá)TLR5對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率和凋亡率的影響Fig.3 Effects of low expression of TLR5 on survival rate and apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease

2.4 miR-449a靶向TLR5，調(diào)控TLR5蛋白的表達(dá)Starbase預(yù)測(cè)miR-449a的靶基因（圖4A），發(fā)現(xiàn)miR-449a與TLR5-3'UTR之間存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶活性檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證（圖4B），結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-449a組轉(zhuǎn)染TLR5-3'UTR-WT細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR-449a組轉(zhuǎn)染TLR5-3'UTR-MUT的細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明（圖4C），miR-449a組TLR5蛋白表達(dá)水平明顯低于miR-NC組；anti-miR-449a組TLR5蛋白表達(dá)水平明顯高于anti-miR-NC組（P＜0.05）。

圖4 miR-449a靶向TLR5調(diào)控TLR5蛋白表達(dá)Fig.4 miR-449a targets TLR5 and regulates expression of TLR5 protein

2.5 高表達(dá)TLR5可以逆轉(zhuǎn)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率和凋亡率的影響在風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-449a模擬物和TLR5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-TLR5，結(jié)果顯示（圖5、表3），與miR-449a+pcDNA-NC組 比 較，miR-449a+pcDNATLR5組風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞的TLR5蛋白表達(dá)水平明顯升高，Ki67蛋白表達(dá)水平顯著降低，Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞存活率明顯減少，細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。

表3 高表達(dá)TLR5可逆轉(zhuǎn)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.3 Over expression of TLR5 can reverse effect of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

表3 高表達(dá)TLR5可逆轉(zhuǎn)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n=9）Tab.3 Over expression of TLR5 can reverse effect of miR-449a on apoptosis rate of myocardial cells in rheumatic heart disease（±s，n=9）

Note：Compared with miR-449a+pcDNA-NC，1）P＜0.05.

Groups miR-449a+pcDNA-NC miR-449a+pcDNA-TLR5 t P Apoptosis rate（%）10.52±0.93 20.36±1.831）14.381 0.000

圖5 高表達(dá)TLR5可逆轉(zhuǎn)miR-449a對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Over expression of TLR5 can reverse effects of miR-449a on cardiomyocyte survival and apoptosis in rheumatic heart disease

2.6 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況以及炎癥因子的釋放水平對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果表明（圖6、表4），與miR-NC組比較，miR-449a組風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞中p-p65和p-IκBα蛋白表達(dá)水平、IL-1β、TNF-α水平明顯降低（P＜0.05）；同時(shí)高表達(dá)TLR5后，相比于miR-449a+pcDNA-NC組，miR-449a+pcDNA-TLR5組p-p65和p-IκBα蛋白的表達(dá)水平、IL-1β、TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）。

圖6 Western blot檢測(cè)p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)Fig.6 Western blot detection of p-p65，p-IκBαprotein expressions

表4 各組處理細(xì)胞炎癥因子的釋放水平（±s，n=9）Tab.4 Release levels of inflammatory factors in treated cells in each group（±s，n=9）

表4 各組處理細(xì)胞炎癥因子的釋放水平（±s，n=9）Tab.4 Release levels of inflammatory factors in treated cells in each group（±s，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P＜0.05；compared with miR-449a+pcDNA-NC，2）P＜0.05.

Groups miR-NC miR-449a miR-449a+pcDNA-NC miR-449a+pcDNA-TLR5 F P IL-1β/（pg·ml-1）63.02±6.02 31.05±3.011）28.63±2.86 54.16±5.162）130.139 0.000 TNF-α/（pg·ml-1）2.09±0.17 0.96±0.091）0.94±0.08 1.73±0.152）179.654 0.000

3 討論

盡管在風(fēng)濕性心臟病的發(fā)病過(guò)程中已經(jīng)了解了一些miRNA的分子機(jī)制，但在其發(fā)展過(guò)程中，miR-449a表達(dá)的特定模式仍然知之甚少。因此，有必要深入研究風(fēng)濕性心臟病的miR-449a功能，并開發(fā)其在風(fēng)濕性心臟病惡性進(jìn)展中的新調(diào)節(jié)作用。本研究探索了miR-449a作用及其潛在機(jī)制。通過(guò)功能獲得實(shí)驗(yàn)來(lái)分析miR-449a在風(fēng)濕性心臟病中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-449a在風(fēng)濕性心臟病患者外周血中的表達(dá)較低，當(dāng)miR-449a高表達(dá)時(shí)，風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞增殖被促進(jìn)，且細(xì)胞凋亡、炎癥因子的釋放被抑制，機(jī)制與靶向TLR5、調(diào)控NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，這證明了miR-449a作為風(fēng)濕性心臟病生物標(biāo)志和治療靶點(diǎn)的巨大潛力。

首先，本研究發(fā)現(xiàn)miR-449a的表達(dá)在風(fēng)濕性心臟病患者外周血中被下調(diào)。該結(jié)果表明miR-449a參與了風(fēng)濕性心臟病。先前的研究表明，miRNA異常表達(dá)與疾病多種生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，包括風(fēng)濕性心臟病［8-9］。為了揭示miR-449a在風(fēng)濕性心臟病中的作用，利用MTT和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試miR-449a對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-449a過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)風(fēng)濕性心臟病細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子的釋放。miR-449a位于染色體5q11，是miR-34家族成員之一，此前已被報(bào)道在幾種人類疾病中顯著下調(diào)，包括骨肉瘤、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等，表明其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的抑癌作用［10-12］。除此之外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中檢測(cè)到了miR-449a的下調(diào)，miR-449a通過(guò)靶向高遷移率族蛋白1起著抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞增殖，遷移和炎癥的作用［13］。在腦缺血損傷中，miR-449a被下調(diào)，在缺血/再灌注損傷模型中，miR-449a的過(guò)表達(dá)可以恢復(fù)神經(jīng)功能，保護(hù)腦缺血性損傷［14］。本研究證明，miR-449a是風(fēng)濕性心臟病發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵分子，也是miRNA替代療法的合適候選者。

本研究表明，TLR5 mRNA和TLR5蛋白的表達(dá)在風(fēng)濕性心臟病患者外周血中顯著升高。根據(jù)報(bào)道，TLR5基因的遺傳變異與中國(guó)漢族人群的風(fēng)濕性心臟病有關(guān)，其基因多態(tài)性可能是識(shí)別易感人群風(fēng)濕性心臟病高危人群的有用標(biāo)志［15-16］。在心肌缺血再灌注損傷后，TLR5的缺乏促進(jìn)了梗死面積的增加和心肌氧化應(yīng)激，加劇急性左心室功能障礙［17］。本實(shí)驗(yàn)利用TLR5小干擾RNA干擾TLR5的表達(dá)，結(jié)果顯示，低表達(dá)TLR5后，風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞的Ki67蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞存活率明顯增加，Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)水平、凋亡率顯著降低。miRNA通常通過(guò)直接結(jié)合mRNA的3'UTR執(zhí)行生物學(xué)功能［18］。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)使用Starbase確定TLR5是miR-449a的預(yù)測(cè)靶標(biāo)。雙熒光素酶活性測(cè)定表明miR-449a直接靶向TLR5。Western blot分析證實(shí)，miR-449a在風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞中負(fù)調(diào)控TLR5的表達(dá)。此外，高表達(dá)TLR5后，miR-449a促進(jìn)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞增殖、Ki67蛋白表達(dá)的作用，以及抑制細(xì)胞凋亡、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的作用被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，TLR5是風(fēng)濕性心臟病中miR-449a的靶標(biāo)。

NF-κB信號(hào)通路的活化有助于風(fēng)濕性心臟病的發(fā)生和發(fā)展，這與炎癥因子IL-1β、TNF-α的釋放密切相關(guān)［19-21］。TLR5沉默可通過(guò)失活NF-κB和MAPK信號(hào)來(lái)抑制肝細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而減輕高氨血癥所致的肝損傷［22］。TLR5激活人類牙髓細(xì)胞中的NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎癥介質(zhì)尿激酶纖溶酶原激活物的表達(dá)［23］。miR-449a通過(guò)靶向HMGB1介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌的腫瘤生長(zhǎng)、遷移和侵襲［24］。本研究證明，miR-449a下調(diào)了NF-κB信號(hào)通路活性。但是在高表達(dá)TLR5后，miR-449a模擬物對(duì)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞中p-p65、p-IκBα蛋白表達(dá)和炎癥因子IL-1β、TNF-α釋放的影響被逆轉(zhuǎn)。說(shuō)明miR-449a可能通過(guò)下調(diào)TLR5抑制NF-κB途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖并減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-449a在風(fēng)濕性心臟病中起保護(hù)作用，可以促進(jìn)風(fēng)濕性心臟病心肌細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡和炎癥因子水平，作用機(jī)制與靶向TLR5抑制NF-κB信號(hào)通路活性有關(guān)。因此，miR-449a可能成為治療風(fēng)濕性心臟病的潛在治療靶標(biāo)。