白藜蘆醇調(diào)控細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展*

劉柯，石瑾，丁軍穎

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院/北京市中醫(yī)藥研究所/中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點實驗室，北京 100010；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

由于我國部分地區(qū)抗生素使用尚不規(guī)范，使抗生素對耐藥菌療效乏力的同時反倒成為其耐藥進(jìn)化的動力，致使多耐藥、泛耐藥菌頻現(xiàn)，甚至出現(xiàn)極度耐藥的“超級細(xì)菌”[1]。臨床上，耐藥菌感染常因抗生素治療無效而進(jìn)展至重癥，甚至死亡[2]。因此，迫切需要開發(fā)不易引起細(xì)菌耐藥的非抗生素新藥。近年來，中草藥以其能延緩細(xì)菌耐藥出現(xiàn)時間，甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的特性而備受關(guān)注[3]。白藜蘆醇在植物體內(nèi)以虎杖苷的形式存在，也是中藥虎杖的核心活性成分。白藜蘆醇對革蘭氏陰性及陽性菌[4-8]、病毒[9-10]、真菌[11]及衣原體[12]等抑制作用明確，尤其可通過干擾細(xì)菌生物膜的形成、抑制藥物外排泵的功能、增加細(xì)胞的通透性及修飾藥物作用的靶點等參與細(xì)菌耐藥的調(diào)控。此外，白藜蘆醇還可作為抗菌增效劑增加細(xì)菌對抗生素的敏感性，提高抗生素的療效。本文將對白藜蘆醇調(diào)控細(xì)菌耐藥性的相關(guān)機制予以綜述，以期為抗感染中醫(yī)藥的研發(fā)、耐藥菌感染的診治提供新思路。

1 細(xì)菌感染的治療困境——耐藥

近年來，我國耐藥菌的檢出率逐年攀升。相關(guān)細(xì)菌耐藥數(shù)據(jù)表明，金黃色葡萄球菌對青霉素G的耐藥率高達(dá)93%，大腸埃希菌對氨芐西林耐藥率也高達(dá)88%，鮑曼不動桿菌對頭孢曲松、頭孢他啶耐藥率在70%以上[13]。最新的全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2020年碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌、碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌及泛耐藥甚至全耐藥的鮑曼不動桿菌等革蘭氏陰性菌的檢出率仍處于較高水平[14]?？梢姡?xì)菌耐藥目前已成為國內(nèi)醫(yī)學(xué)界亟待解決的重大科學(xué)問題。

面對防治細(xì)菌耐藥的困境，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以回復(fù)突變?yōu)橹饕碚撘罁?jù)，通過不斷升級抗生素提高療效，但結(jié)果并不十分理想：因新型抗生素研發(fā)多滯后于耐藥菌的出現(xiàn)，存在誘發(fā)新耐藥菌株的風(fēng)險。幾乎每種新型抗生素問世不久，針對該抗生素的耐藥菌就會隨即出現(xiàn)，以致抗生素使用期限越來越短。尤為重要的是，抗生素用量增加也是細(xì)菌耐藥性增強和對抗生素選擇壓力升級的主要原因，即耐藥菌產(chǎn)生的根源就是抗生素[15]。研發(fā)不易耐藥的非抗生素新藥迫在眉睫，而中藥因不易引起細(xì)菌耐藥的特性而備受關(guān)注。

2 白藜蘆醇抑菌作用明確，抑菌譜廣泛

白藜蘆醇具備中藥不易引起耐藥的共同特性，且來源豐富。在虎杖地下根及根莖中含量很高，也廣泛存在于藜蘆、何首烏及花生、葡萄等其他植物中。自然界中，當(dāng)植物遭遇病原侵害時，白藜蘆醇會應(yīng)激性合成增加而抵御病原，故有“植物抗菌素”之稱[16]。白藜蘆醇主要以虎杖苷的形式存在于虎杖根莖中?；⒄溶帐前邹继J醇的糖苷形式，在糖苷酶作用下可轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。二者具有相似的抑菌作用，包括抗炎、抗病毒、抗菌和抗氧化等。將虎杖根莖中的虎杖苷高效轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，是目前獲取白藜蘆醇的主要方法[17]。

白藜蘆醇對革蘭氏陰性及陽性菌均有明確的抑制和殺滅作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過減少角膜上皮細(xì)胞受體蛋白TLR2的含量，使金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)和分泌減少[4]。研究亦表明，白藜蘆醇可干擾腸球菌細(xì)胞壁的合成，從而使菌體扭曲變形，致使腸球菌裂解死亡[5]。另外，也可通過下調(diào)主導(dǎo)細(xì)胞分裂的關(guān)鍵蛋白ftsZ的表達(dá)，使大腸桿菌處于生長抑制狀態(tài)[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇以濃度依賴性的方式顯著抑制霍亂弧菌[7]和銅綠假單胞菌[8]生物膜的形成，降低細(xì)菌的耐藥性。

白藜蘆醇對病毒、真菌及衣原體亦有抑制效果。白藜蘆醇通過調(diào)控核糖體功能，阻斷病毒蛋白的翻譯，從而抑制流感病毒和呼吸道合胞病毒復(fù)制，顯示出對流感病毒、呼吸道合胞病毒的顯著抗病毒活性[9]。值得一提的是，與洛匹那韋/利托那韋相比，白藜蘆醇還能更有效地阻礙新型冠狀病毒的復(fù)制[10]。另外，白藜蘆醇還可提高白色念珠菌的活性氧水平，致使線粒體損傷，從而誘導(dǎo)白色念珠菌的細(xì)胞凋亡[11]。而且白藜蘆醇可通過降低肺炎衣原體感染細(xì)胞中IL-17和IL-23的產(chǎn)生，對衣原體顯示出明確的生長抑制作用[12]。總之，白藜蘆醇抑菌作用明確，且對微生物的抑制范圍廣泛，深層機制值得進(jìn)一步探索。

3 白藜蘆醇調(diào)控細(xì)菌耐藥性的可能機制

3.1 干擾生物膜形成生物膜作為抗菌藥物向菌體內(nèi)滲透的天然屏障，可阻礙抗生素向菌體內(nèi)的擴散，降低菌體內(nèi)抗菌藥物濃度，增強細(xì)菌耐藥性；還可導(dǎo)致膜內(nèi)營養(yǎng)不足，迫使細(xì)菌通過基因調(diào)控等方式降低自身代謝水平，甚至進(jìn)入休眠狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)菌對藥物的敏感性降低[18]。因此，生物膜相關(guān)的細(xì)菌耐藥性主要是由抗生素的滲透障礙及膜內(nèi)細(xì)菌生長速度減慢所致。生物膜是細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致耐藥菌感染性疾病遷延不愈的重要原因，抑制或破壞細(xì)菌生物膜可有效降低細(xì)菌耐藥性。

白藜蘆醇對細(xì)菌生物膜的干擾作用涉及多個層面。首先可通過群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)干預(yù)生物膜的形成。譚宏亮等[19]發(fā)現(xiàn)64 mg·L-1的白藜蘆醇對嗜水氣單胞菌生物膜抑制率可達(dá)40.5%，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果進(jìn)一步證實，白藜蘆醇通過上調(diào)嗜水氣單胞菌Ⅰ型群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)的luxR基因表達(dá)，下調(diào)Ⅱ型群感調(diào)控系統(tǒng)的luxS基因表達(dá)，繼而影響嗜水氣單胞菌生物膜形成，最終實現(xiàn)對細(xì)菌耐藥性的調(diào)控。白藜蘆醇還可通過調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)抑制生物膜的形成甚至可清除大腸埃希菌已形成的生物膜。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)中的蛋白表達(dá)水平，尤其是趨化蛋白CheY、CheZ抑制生物膜的形成[20]。另外，白藜蘆醇還可通過減少膜蛋白和胞外多糖含量，抑制生物膜的形成。據(jù)報道，白藜蘆醇下調(diào)編碼外膜蛋白合成相關(guān)基因w、yedS、ompK的表達(dá)的同時，細(xì)胞膜蛋白及胞外多糖含量減少，生物膜的黏附及合成明顯被抑制，生物膜結(jié)構(gòu)趨于松散，最終實現(xiàn)對細(xì)菌耐藥性的調(diào)控[21]。此外，白藜蘆醇通過影響細(xì)菌鞭毛抑制生物膜的形成。隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增大，蜂房哈夫尼菌生物膜逐漸裂解，遷移距離逐漸縮短[22]。此機制與胞內(nèi)第二信使環(huán)二鳥苷酸(cyclic diguanylate，c-di-GMP)系統(tǒng)有關(guān)，c-di-GMP參與調(diào)節(jié)細(xì)菌的多種生理功能，包括細(xì)菌游動性和生物被膜形成等[23]。白藜蘆醇通過調(diào)控c-di-GMP系統(tǒng)影響細(xì)菌游動性，從而干擾細(xì)菌生物膜形成，進(jìn)而降低細(xì)菌耐藥性。

總之，白藜蘆醇可通過影響群體感應(yīng)調(diào)控的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)雙組分系統(tǒng)中的趨化蛋白水平，下調(diào)表達(dá)編碼外膜蛋白合成的相關(guān)基因，調(diào)控胞內(nèi)第二信使c-di-GMP系統(tǒng)等影響細(xì)菌生物膜的形成，最終實現(xiàn)對細(xì)菌耐藥性的調(diào)控。

3.2 抑制外排泵功能外排泵系統(tǒng)可將胞內(nèi)藥物排至胞外，通過降低菌體內(nèi)有效藥物濃度阻礙藥效發(fā)揮，使細(xì)菌呈現(xiàn)耐藥性。因外排泵可非特異性外排多種抗生素[24]，所以常使細(xì)菌產(chǎn)生多耐藥、泛耐藥性。因此，抑制細(xì)菌外排泵功能是調(diào)控細(xì)菌耐藥，尤其泛耐藥、多耐藥的有效途徑，積極尋求細(xì)菌外排泵抑制劑是可能的治療策略。

白藜蘆醇可通過抑制外排泵功能延緩細(xì)菌耐藥的出現(xiàn)。據(jù)報道，AcrAB-TolC是大腸桿菌最重要的外排泵，白藜蘆醇通過下調(diào)TolC的表達(dá)可有效抑制AcrAB-TolC的外排功能，且可劑量依賴性阻斷。白藜蘆醇可顯著降低TolC啟動子活性，從而顯著下調(diào)TolC的表達(dá)，最終實現(xiàn)AcrAB-TolC對藥物的主動外排抑制[25]。AdeABC外排泵可非特異外排多種抗菌藥物，是鮑曼不動桿菌泛耐藥的直接原因。據(jù)報道，白藜蘆醇可顯著抑制AdeABC外排泵的表達(dá)，增加鮑曼不動桿菌對氯己定的敏感性，同時成倍降低氯己定的最低抑菌濃度[26]。此外，ATP介導(dǎo)的多藥耐藥蛋白是導(dǎo)致細(xì)菌多藥耐藥的另一主要原因。由多藥耐藥基因編碼的P-糖蛋白可通過ATP水解釋放能量，將藥物泵出以降低胞內(nèi)藥物濃度，從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[27]。反式白藜蘆醇及其糖苷化合物則可有效抑制P-糖蛋白的泵出，逆轉(zhuǎn)其耐藥性，尤需注意的是低劑量對細(xì)胞基本無毒性作用，但逆轉(zhuǎn)耐藥作用卻非常顯著[28]。總之，白藜蘆醇是一種有效的外排泵抑制劑，可有效改變細(xì)菌耐藥性。

3.3 增加細(xì)胞通透性臨床耐藥菌感染因抗生素療效乏力而成為全球醫(yī)學(xué)界的難題，尤其多重耐藥的革蘭氏陰性菌感染率較高[29]。它具有獨特的外膜結(jié)構(gòu)，可有效屏蔽抗生素，是調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性和抗生素耐藥的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。外膜低滲透性與外排泵具有協(xié)同作用，已有證據(jù)證實二者共同導(dǎo)致了革蘭氏陰性菌的耐藥窘境[30]。另外，在革蘭氏陽性菌中，細(xì)胞壁及細(xì)胞膜通透性也是影響其耐藥的主要因素。

白藜蘆醇可通過抑制編碼外膜蛋白基因，下調(diào)外膜蛋白表達(dá)，增加革蘭氏陰性菌的外膜通透性，使抗生素順利進(jìn)入菌體內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控其耐藥性[31]。就革蘭氏陽性菌而言，白藜蘆醇可通過增加其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的通透性，使藥物進(jìn)入菌體，繼而干擾核酸、蛋白質(zhì)等阻礙細(xì)胞器的合成，導(dǎo)致細(xì)胞器破壞和/或結(jié)構(gòu)溶解，進(jìn)而影響耐藥菌的生長代謝。據(jù)報道，白藜蘆醇可阻礙細(xì)胞壁的肽糖聚合所需的糖肽基和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，抑制腸球菌細(xì)胞壁的合成，使腸球菌結(jié)構(gòu)破壞，胞壁破損，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)內(nèi)含物消失或呈現(xiàn)空泡樣改變，從而增加細(xì)胞通透性，提高抗菌藥物通過率，進(jìn)而解決細(xì)菌的耐藥性問題[5]。另外，白藜蘆醇還可通過調(diào)控NF-κB信號通路改變革蘭陽性菌的通透性，甚至通過呼吸道上皮細(xì)胞分泌的具有天然抗菌活性的免疫蛋白—短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate，lung and nasal epithelial clone 1，SPLUNC1)蛋白，調(diào)節(jié)離散小孔的形成，增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性。尤其白藜蘆醇作為天然的SIRT1激活劑，可通過抑制NF-κB炎癥信號通路，下調(diào)相關(guān)炎癥因子表達(dá)，影響SPLUNC1的分泌，從而增加細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而影響抗菌藥物的通過率，最終實現(xiàn)改變細(xì)菌耐藥性的效果[32]。

3.4 改善藥物作用靶點抗生素作用靶點的改變是細(xì)菌耐藥的另一重要機制[33]：①新型靶蛋白的產(chǎn)生：細(xì)菌與抗生素接觸之后產(chǎn)生新的靶蛋白，使抗生素不能與其有效結(jié)合，從而降低抗生素的親和力，產(chǎn)生耐藥性；②靶蛋白數(shù)量的改變：靶蛋白數(shù)量的增加使抗生素存在時仍有過量靶蛋白，維持細(xì)菌的生長增殖；③作用靶點的丟失：靶點丟失直接導(dǎo)致抗菌藥物不能與其結(jié)合而失效，以銅綠假單胞菌為例，lpxC或lpxO2基因突變，使脂質(zhì)A的生物合成障礙，多黏菌素作用靶點丟失，導(dǎo)致銅綠假單胞菌對多黏菌素的耐藥性顯著增高[34]。

白藜蘆醇可通過修飾藥物作用靶點而改善耐藥菌的感染。據(jù)報道，白藜蘆醇可通過影響甲基化和乙?；傅谋磉_(dá)，可改變啟動子組蛋白的表觀遺傳修飾——進(jìn)而降低甲基化水平，增加乙酰化水平，最終影響耐藥菌的致病性[35]。另外，白藜蘆醇作為非選擇性腺苷的受體激動劑，還可通過靶向作用質(zhì)膜的腺苷受體，影響基因轉(zhuǎn)錄、受體表達(dá)及下游腺苷酸環(huán)化酶AC/PKA的活化通路[36]，甚至通過增加AMPKα的磷酸化水平抑制NF-κB信號通路，進(jìn)而下調(diào)其下游藥物外排泵——P-糖蛋白的表達(dá)，降低其細(xì)菌耐藥性[37]。白藜蘆醇還可通過結(jié)合并還原銅離子，生成氧化銅復(fù)合物和活性氧，破壞質(zhì)粒DNA的完整性，導(dǎo)致大腸桿菌的細(xì)胞周期顯著阻滯[38]。另有研究表明，白藜蘆醇亦可直接刺激線粒體，誘導(dǎo)鼠傷寒桿菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高NADPH氧化酶活性，產(chǎn)生大量活性氧，上調(diào)抑制蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致DNA損傷，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[39]?？傊?，藥物作用靶點的不同修飾均可影響細(xì)菌對靶向藥物的敏感性，基于此，白藜蘆醇相關(guān)藥物的開發(fā)頗具前景。

3.5 抗菌增效劑抗菌中草藥常作為增效減毒劑與抗生素聯(lián)用[40]，降低抗生素細(xì)胞毒性的同時，可增加細(xì)菌對抗生素的敏感性；也可在提高抗生素藥效的基礎(chǔ)上，有效延緩細(xì)菌的耐藥時限。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芪歸銀方作為扶正透邪的代表方劑，可通過改變參與細(xì)菌生物膜形成的ArcA和IscU等蛋白的表達(dá)水平來調(diào)節(jié)銅綠假單胞菌的耐藥性，一定程度上恢復(fù)耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的敏感性[3]，提示中草藥作為抗生素增效劑的潛在可能。白藜蘆醇和虎杖苷在一定條件下可相互轉(zhuǎn)化，兩者皆是中藥虎杖的核心生物活性成分，虎杖亦是芪歸銀方的關(guān)鍵藥味。因此，在確證芪歸銀方協(xié)同抗菌療效基礎(chǔ)上，需進(jìn)一步關(guān)注白藜蘆醇或虎杖苷的抗菌抑炎機制。

已有研究證明，白藜蘆醇可增強抗生素對耐藥菌的消殺作用。以對多黏菌素B耐藥的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌為例，研究發(fā)現(xiàn)二者對多黏菌素B的最低抑菌濃度因添加白藜蘆醇而顯著下降，下降程度與白藜蘆醇濃度呈劑量依賴性[41]。陳尚岳等[42]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與苯唑西林、環(huán)丙沙星聯(lián)用時，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用均顯著增強。細(xì)胞毒性實驗進(jìn)一步表明，環(huán)丙沙星或苯唑西林單用時，小鼠細(xì)胞的存活率分別為93.8%和94.5%，聯(lián)用白藜蘆醇后，細(xì)胞存活率分別增至95.3%和96.1%，說明白藜蘆醇作為抗生素的增效劑，不僅提高了抗生素藥效，還降低了抗生素的細(xì)胞毒性作用。另據(jù)報道，白藜蘆醇與抗生素聯(lián)用還可顯著抑制耐藥菌生物膜的形成，使細(xì)菌耐藥性和致病性均明顯減弱：與萬古霉素聯(lián)用時，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的抑制率從單用時的27.71%增至55.43%[43]。白藜蘆醇甚至可通過下調(diào)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)中l(wèi)asI和rhlI基因的表達(dá)，增強氨基糖苷類抗生素對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用，即恢復(fù)對氨基糖苷類抗生素的敏感性，這均有力證實白藜蘆醇與抗生素對耐藥菌的協(xié)同療效[8]。

綜上所述，耐藥菌感染日益嚴(yán)峻，在抗生素對耐藥菌療效乏力的背景下，基于中藥不易引起耐藥的特性，成分明確的中藥單體聯(lián)合抗生素的協(xié)同治療可能是應(yīng)對耐藥菌感染的潛在方法。

4 結(jié)論與展望

抗生素的殺菌抑菌療效毋庸置疑，但隨著細(xì)菌耐藥狀況的加重，使抗生素非但不能有效抗菌，反倒成為細(xì)菌耐藥的動力，因此，研發(fā)不易引起耐藥的新型非抗生素藥物勢在必行。白藜蘆醇治療耐藥菌感染有多重優(yōu)勢：①具備中藥不易引起細(xì)菌耐藥的共性，且較中藥復(fù)方成分更明確；②白藜蘆醇以虎杖苷的形式廣泛存在于虎杖及其他植物中，易獲取；③其部分抑菌作用已得到證實，且抑菌譜廣泛；④抑菌機制多樣，包括干擾生物膜形成、抑制外排泵功能、增加細(xì)胞通透性、改善藥物作用靶點等；⑤可協(xié)同增效抗生素，實現(xiàn)對細(xì)菌耐藥特性的有益調(diào)控。以上多著眼于細(xì)菌的耐藥機制闡述，然而，結(jié)合中藥免疫調(diào)理特點闡釋白藜蘆醇對細(xì)菌耐藥機制改變的報道尚不多見，尤其是結(jié)合HMGB1這一免疫網(wǎng)絡(luò)核心調(diào)控分子的研究尚不夠詳盡，值得進(jìn)一步探索。

已知虎杖是芪歸銀方的關(guān)鍵藥味，虎杖苷是白藜蘆醇的糖苷形式，二者均是虎杖的核心生物活性成分。本課題組前期已證實，芪歸銀方所有組分均無明顯毒副作用，為白藜蘆醇、虎杖苷等單體藥物開發(fā)的安全性奠定了基礎(chǔ)[44]。另有報道，白藜蘆醇及虎杖苷胃腸道吸收均良好[45]，為其給藥方式及臨床口服劑型的探索提供了保障。上述研究均提示基于病原體/機體免疫，全面揭示了白藜蘆醇調(diào)控細(xì)菌耐藥機制的單體中藥研發(fā)的迫切必要及潛在可能。