血細(xì)胞計數(shù)及功能與腫瘤患者靜脈血栓栓塞癥相關(guān)性研究進(jìn)展

柯立暉，李 輝

靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE)是嚴(yán)重威脅患者生命安全的疾病，其包括深靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)及急性肺栓塞。VTE的發(fā)生與多種危險因素有關(guān)，包括患者年齡、懷孕狀態(tài)、長期臥床、急性感染、手術(shù)、肥胖、惡性腫瘤等。由于疾病類型不同及患者流行病學(xué)特征的差異，VTE的發(fā)生率在各類疾病之間也相差較大。相較于非腫瘤患者，腫瘤患者VTE的發(fā)生率顯著提高。數(shù)據(jù)顯示大約有20%的癌癥患者會發(fā)生VTE，并且大多發(fā)生在確診及治療的早期階段，VTE導(dǎo)致癌癥患者死亡約占全部死亡總數(shù)的20%～30%[1]。由于腫瘤患者需要接受一系列抗腫瘤治療，包括手術(shù)、輔助放化療等，這些因素會額外增加發(fā)生VTE的風(fēng)險。所以對于這部分患者而言，有效的血栓預(yù)防措施是至關(guān)重要的。目前主流的觀點認(rèn)為，住院腫瘤患者應(yīng)該進(jìn)行血栓風(fēng)險評估，及時接受有效的血栓預(yù)防，主要的預(yù)防措施包括機(jī)械預(yù)防和藥物預(yù)防。靜脈血栓預(yù)防藥物主要包括皮下注射的抗凝劑(如低分子肝素)以及新型口服抗凝藥物(如利伐沙班)。但需要注意的是，在整個抗腫瘤治療期間，特別是治療早期，患者不僅血栓的發(fā)生風(fēng)險增加，同時出血概率也隨之增長，這就造成在預(yù)防抗凝的同時可能會導(dǎo)致患者出血。特別是高齡或者合并多種疾病的患者，其對于抗凝藥物的敏感性可能存在巨大差異，這會極大影響抗凝藥物在臨床上的使用[2]。而對于門診患者，由于缺乏有效的監(jiān)測手段，保證抗凝藥物在有效降低血栓風(fēng)險的同時不增加出血更是一項艱巨的任務(wù)，所以目前指南只推薦血栓風(fēng)險高的患者在經(jīng)過充分評估和溝通后才進(jìn)行預(yù)防性的抗凝治療[3]。因此，對血栓高危人群的識別是決定相應(yīng)預(yù)防措施及預(yù)防強(qiáng)度的重要前提。在過去的十多年間，有許多臨床預(yù)測模型被開發(fā)并利用于識別發(fā)生血栓的高?；颊摺aprini評分作為最早用于VTE預(yù)測及血栓預(yù)防指導(dǎo)的臨床模型，納入將近40個臨床危險因素，但是不包括任何實驗室化驗指標(biāo)。在腫瘤領(lǐng)域，最為熟知的是Khorana評分，該評分主要用于預(yù)測接受化療患者發(fā)生VTE的風(fēng)險[4]。雖然Khorana評分評估了血小板、中性粒細(xì)胞、血紅蛋白對血栓發(fā)生的影響，但是也僅僅停留于簡單的濃度測量。在外部驗證中，Khorana評分對中高危人群的區(qū)分能力不盡如人意[5]，通過納入D-二聚體后的改良Khorana評分能有效提高對高?；颊叩淖R別能力[6]。Caprini評分也存在同樣的問題，在加入D-二聚體后也能有效提高評分在肺癌患者中的高危人群識別能力[7]。近年，越來越多的臨床預(yù)測模型開始將血栓相關(guān)指標(biāo)作為構(gòu)建模型的重要內(nèi)容，而D-二聚體仍是目前最為廣泛接受的預(yù)測血栓的標(biāo)志物[8]。即使這樣，現(xiàn)有評分模型預(yù)測腫瘤患者發(fā)生VTE的效度仍較差，想要借助模型提高預(yù)防血栓的臨床決策能力亟需提高風(fēng)險模型的預(yù)測能力。探索發(fā)現(xiàn)新型血栓相關(guān)標(biāo)志物是近些年的研究熱點，包括凝血因子、炎癥相關(guān)指標(biāo)、內(nèi)皮功能指標(biāo)、血細(xì)胞成分及功能指標(biāo)、代謝組學(xué)及基因組學(xué)等。雖然大量的分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)與VTE的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)，但相關(guān)研究的樣本量均較小，在不同種類癌癥之間的檢驗效度缺乏一致性[9]。在靜脈血栓的形成過程中，除了凝血因子之間的級聯(lián)反應(yīng)促使纖維蛋白原凝結(jié)外，血細(xì)胞成分也發(fā)揮著重要的促凝作用并直接參與血栓形成。由于血細(xì)胞在血液中穩(wěn)定存在，因此探索血細(xì)胞計數(shù)及功能與VTE形成之間的關(guān)系是未來可靠的研究方向。

1 血細(xì)胞計數(shù)與VTE

研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)目增高與癌癥患者VTE發(fā)生風(fēng)險增高有關(guān)，白細(xì)胞數(shù)量若升高2倍以上，患者發(fā)生VTE的風(fēng)險系數(shù)將提高1.15倍[10]。因此，白細(xì)胞計數(shù)在許多風(fēng)險模型中被當(dāng)做一項重要的預(yù)測指標(biāo)，白細(xì)胞計數(shù)>11×109/L被認(rèn)為是影響血栓形成的獨立危險因素而被納入Khorana評分中[11]。白細(xì)胞中數(shù)量較多的成分包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞數(shù)量增加是促進(jìn)血栓形成的危險因素[12]；而關(guān)于淋巴細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)其計數(shù)增高對肺癌術(shù)后患者VTE發(fā)生具有保護(hù)作用[13]；但在腦膠質(zhì)瘤患者人群中，外周淋巴細(xì)胞計數(shù)增高卻與VTE風(fēng)險增高顯著相關(guān)[14]。由于白細(xì)胞中不同類型細(xì)胞比例在疾病進(jìn)展過程中會動態(tài)變化，因此單純采用數(shù)量變化來預(yù)測VTE具有極大的不確定性。采納細(xì)胞成分?jǐn)?shù)目比值被認(rèn)為是更為科學(xué)的做法，各類比值包括中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophil/lymphocyte ratio,NLR)、血小板/淋巴細(xì)胞比值(platelet/lymphocyte ratio,PLR)、單核細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(monocyte/lymphocyte ratio,MLR)等。這些比值的計算來源于既有的血常規(guī)結(jié)果，無需額外的檢查，卻表現(xiàn)出更優(yōu)異的VTE預(yù)測能力[15]。NLR對VTE的發(fā)生具有較高的預(yù)測能力(AUC=0.893，P<0.001)，且被認(rèn)為是急性肺栓塞的獨立危險因素[16]。相較于單純應(yīng)用D-二聚體，NLR/D-二聚體比值可提供更優(yōu)的肺栓塞預(yù)測能力，其靈敏度和特異度分別是97.4%和96.7%。NLR也與VTE相關(guān)死亡風(fēng)險有關(guān)。一項納入128例VTE患者的隊列研究中發(fā)現(xiàn)，NLR升高與VTE的發(fā)生顯著相關(guān)(HR=2.13，95%CI：1.26～3.58，P<0.05)，同時也與患者2年死亡率顯著相關(guān)(HR=1.2，95%CI：1.0～1.4，P<0.05)[17]。單核細(xì)胞作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分參與炎癥反應(yīng)，同樣被發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測VTE的價值。一項研究發(fā)現(xiàn)，在28例發(fā)生VTE的患者中，單核細(xì)胞計數(shù)顯著高于其他280例非VTE患者(P=0.013)[18]。但是其預(yù)測價值在腫瘤患者中卻比較有限。在最新一項關(guān)于卵巢癌相關(guān)VTE的觀察性研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生VTE的患者雖然單核細(xì)胞計數(shù)顯著增加，但統(tǒng)計結(jié)果并不支持單核細(xì)胞計數(shù)是預(yù)測VTE和相關(guān)死亡的獨立危險因素[19]。同樣，雖然發(fā)生VTE的患者M(jìn)LR較非VTE患者增高，但是多因素分析結(jié)果提示MLR并不是預(yù)測VTE發(fā)生的獨立危險因素[20]。血小板既是組成血栓的重要成分，也在血栓形成的各個環(huán)節(jié)中扮演重要角色。一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)血小板計數(shù)>350×109/L是預(yù)測VTE發(fā)生的獨立危險因素，且將閾值提高至443×109/L后，結(jié)果仍顯示出統(tǒng)計學(xué)意義[21]。然而PLR在VTE預(yù)測方面的有效性不如NLR可靠，一項納入1 469例腫瘤患者的研究結(jié)果提示，PLR與VTE發(fā)生存在顯著性關(guān)系(P<0.001)[17]。但在另一項納入486例患者的隊列研究中，PLR與VTE發(fā)生率之間并無顯著的關(guān)系[22]。白細(xì)胞計數(shù)及血小板計數(shù)可從血常規(guī)檢查獲得，若未來有更大樣本的研究能支持血細(xì)胞計數(shù)與VTE之間的確切關(guān)系，這將能夠大大減少檢測時間及費用。但目前的研究成果表明，簡單的血細(xì)胞計數(shù)對于VTE預(yù)測的效度仍存在不確定性，這主要源于單純的細(xì)胞計數(shù)難以支持其功能變化在VTE發(fā)生發(fā)展中的作用。對機(jī)制探索的不斷深入也表明細(xì)胞功能研究是闡明血栓形成的根本途徑，各類細(xì)胞通過各自功能的表現(xiàn)及互動在VTE形成初始、進(jìn)展、演變的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮著重要作用。

2 血細(xì)胞功能與VTE

2.1中性粒細(xì)胞功能 中性粒細(xì)胞主要通過產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)發(fā)揮其促血栓形成作用。NETs成分主要包含纖維、組蛋白、游離DNA及中性粒細(xì)胞顆粒蛋白等，可來源于細(xì)胞主動釋放或細(xì)胞凋亡后的裂解產(chǎn)物。在血栓形成初期，中性粒細(xì)胞最先到達(dá)血管損傷部位，在激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,GCSF)的刺激下激活并釋放NETs[23]。NETs的主要作用包括：(1)提供血小板、紅細(xì)胞及其他凝血因子聚集的位點；(2)NETs中的組蛋白成分可通過與血小板膜上Toll樣受體結(jié)合直接激活血小板[24]，也可以通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)間接激活血小板[25]，由此促進(jìn)血栓形成發(fā)展；(3)NETs中的游離DNA成分能夠通過非組蛋白依賴性途徑激活血小板[26]；(4)NETs中的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶能降解組織因子途徑抑制劑(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)，進(jìn)而加強(qiáng)組織因子(tissue factor,TF)途徑依賴的纖維蛋白凝集，促進(jìn)血栓形成[27]。動物實驗表明，有腫瘤生長的小鼠體內(nèi)NETs的濃度顯著增加[28]，并與炎癥小體協(xié)同促進(jìn)靜脈血栓形成[29]。對其體內(nèi)提取的血栓栓子進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明，血栓內(nèi)含有高濃度的游離DNA和中性粒細(xì)胞標(biāo)志物——淋巴細(xì)胞抗原6G(lymphocyte antigen 6G，Ly6G)。在腫瘤患者中同樣檢測到較非腫瘤患者明顯升高的NETs標(biāo)志物，如核小體、游離DNA及瓜氨酸化組蛋白H3(citrullinated histone H3,H3Cit)等，且H3Cit的濃度與凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物及游離P-選擇素濃度呈顯著正相關(guān)[30]。雖然尚無證據(jù)表明NETs能直接促進(jìn)腫瘤患者的血栓形成，但是近期成果發(fā)現(xiàn)人源胰腺癌細(xì)胞能誘導(dǎo)正常細(xì)胞快速生成分泌NETs[31]，從腫瘤患者體內(nèi)分離出的NETs在健康人血液中表現(xiàn)出顯著的促凝作用[32]。由此可見，在腫瘤患者體內(nèi)NETs發(fā)揮著重要的促血栓形成的作用[33]。由于NETs壽命周期短，分離困難，所以目前的臨床研究主要檢測NETs相關(guān)標(biāo)志物。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)，在新確診的936例腫瘤患者中，在肺癌及胰腺癌患者人群中發(fā)現(xiàn)血清H3Cit濃度升高與VTE之間存在顯著關(guān)聯(lián)，但其他標(biāo)志物如核小體及游離DNA與VTE發(fā)生并無顯著性關(guān)系[34]。4型肽?；彼崦搧啺访?peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)在激活并釋放NETs的中性粒細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)[30]，也可作為評估腫瘤患者血栓風(fēng)險的一項指標(biāo)[33]。雖然NETs在肺癌和胰腺癌患者中表現(xiàn)出一定的血栓預(yù)測能力，但仍缺乏普遍適用性，且目前臨床上H3Cit的檢測仍未全面普及，NETs對各類癌癥患者的血栓風(fēng)險評估價值仍有待研究。

2.2淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞功能 腫瘤細(xì)胞本身可以直接釋放多種炎癥介質(zhì)，包括腫瘤壞死因子、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8及內(nèi)皮生長因子等，且各自具有不同的促凝作用，與腫瘤相關(guān)VTE存在一定關(guān)系[9]。淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞是參與炎癥及免疫的重要細(xì)胞，但長期以來，這些細(xì)胞本身在VTE中的作用未得到關(guān)注，主要原因在于上述細(xì)胞因子的檢測相對容易，且多數(shù)研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞分泌的炎癥因子對全身凝血系統(tǒng)的影響占主要地位。有研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子和γ-干擾素也具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF的作用[35]。在卵巢癌患者的隊列研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)生VTE的患者TF表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)目均顯著高于非VTE患者，說明淋巴細(xì)胞也參與到腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)中，并發(fā)揮一定的促血栓形成作用[36]。而對于非腫瘤患者，發(fā)生VTE的人群中確實也發(fā)現(xiàn)了淋巴細(xì)胞功能失調(diào)現(xiàn)象，包括CD4+T細(xì)胞總數(shù)下降、低CD4/CD8比值及B細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡等[37]。值得關(guān)注的是，既往研究發(fā)現(xiàn)低分子肝素和新型口服抗凝藥物能降低DVT患者外周淋巴細(xì)胞IL-6的表達(dá)水平[38-39]。雖然具體機(jī)制有待研究，但是抗凝藥物在預(yù)防血栓中表現(xiàn)出來的降低淋巴細(xì)胞IL-6表達(dá)的能力，也從側(cè)面驗證了淋巴細(xì)胞對于血液高凝狀態(tài)及促血栓形成的獨立作用。雖然關(guān)于單核細(xì)胞參與VTE形成的機(jī)制尚不清楚，但既有的表觀學(xué)研究提示可能與單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞-血小板相互連接聚集有關(guān)[40]。

2.3血小板功能 血小板不僅在動脈血栓形成中占主導(dǎo)地位，在腫瘤患者中，血小板對于VTE的形成也起到關(guān)鍵作用。當(dāng)血管內(nèi)皮發(fā)生損傷，內(nèi)皮下暴露的vWF會與血小板細(xì)胞膜上的糖蛋白Ib(glycoprotein Ib,GPIb)結(jié)合，促進(jìn)血小板活化，活化的血小板通過相應(yīng)受體與二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、血栓烷A2(thromboxane A2，TXA2)和CD40等刺激因子結(jié)合，進(jìn)一步使血小板得到激活并發(fā)生聚集，進(jìn)而與纖維蛋白原交聯(lián)形成血栓。另外，腫瘤細(xì)胞可以直接分泌ADP、TXA2和CD40等血小板刺激因子,進(jìn)而直接激活血小板[9]。腫瘤細(xì)胞還可以通過膜蛋白如腎小球足突細(xì)胞膜黏蛋白與血小板膜受體直接結(jié)合，在其表面形成血小板包膜，這不僅可以幫助腫瘤細(xì)胞躲避免疫監(jiān)視造成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時形成的復(fù)合體也是造成腫瘤相關(guān)血栓的重要誘因[41]。關(guān)于檢測腫瘤患者中血小板激活的功能指標(biāo)的研究眾多，非小細(xì)胞肺癌患者接受化療后，血小板的促凝作用顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸暴露位點增加及血小板來源的微粒(microparticles，MP)數(shù)目增長[42]。MP是細(xì)胞產(chǎn)生脫落的不可分裂的雙層膜結(jié)構(gòu)顆粒，TF陽性的MP在胰腺癌患者的相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)對靜脈血栓生成具有明顯的促進(jìn)作用[43]。MP來源復(fù)雜，腫瘤細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板等都具有分泌MP的能力。最新研究證實來源于血小板的MP可能與DVT之間存在聯(lián)系[44]?？傊?，在腫瘤患者中，大部分血小板相關(guān)指標(biāo)都被檢測到有顯著的升高，但是其中真正對VTE具有預(yù)測作用的很少。有研究發(fā)現(xiàn)一種血小板活化標(biāo)志物——血小板因子4與腫瘤患者發(fā)生VTE存在關(guān)系[45]。此外，最新的研究還發(fā)現(xiàn)血栓烷B2(thromboxane B2，TXB2)、血小板膜表面P-選擇素和CD65對區(qū)分DVT和肺栓塞具有一定價值[46]。目前，血小板功能最常見也最可靠的檢測方法是血栓彈力圖(thromboelastography，TEG)或旋轉(zhuǎn)式血栓彈力計(rotational thromboelastometry，ROTEM)，其中有關(guān)血栓強(qiáng)度的指標(biāo)如血栓最大振幅(maximum amplitude，MA)/最大血栓硬度(maximum clot firmness，MCF)可以反映血小板數(shù)量、血小板激活程度以及與纖維蛋白原的交聯(lián)強(qiáng)度。通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，由TEG檢測到MA升高的血樣所形成的血栓內(nèi)部，激活的血小板偽足與纖維蛋白網(wǎng)格之間廣泛交聯(lián)融合，最直觀地顯示出MA與血小板促血栓形成能力強(qiáng)弱之間的關(guān)系[47]。TEG檢測已被用于評估腫瘤患者的血液高凝狀態(tài)及預(yù)測靜脈血栓形成[48]。研究發(fā)現(xiàn)在膽管細(xì)胞癌患者中，VTE高風(fēng)險的患者M(jìn)CF顯著增高[49]。接受治療的前列腺癌患者相較正常對照組表現(xiàn)出顯著的血液高凝狀態(tài)，TEG結(jié)果也提示高凝患者的MA明顯升高，在12個月的隨訪中，高凝患者發(fā)生VTE的比例明顯高于正常對照組[50]。

3 結(jié)語

血液高凝是促使血栓發(fā)生的重要危險因素，造成血液高凝狀態(tài)不僅取決于各類凝血因子的數(shù)目及功能，血液中存在種類繁多、功能各異的細(xì)胞成分也發(fā)揮著顯著的促血栓形成作用。腫瘤作為一類全身疾病，對全身血液系統(tǒng)具有廣泛而深遠(yuǎn)的作用，不管是在腫瘤細(xì)胞的直接接觸刺激，或是腫瘤釋放的促凝因子間接刺激下，血細(xì)胞的功能狀態(tài)都會發(fā)生變化，最終與腫瘤細(xì)胞一起加重全身高凝狀態(tài)，促進(jìn)血栓形成。對細(xì)胞促凝狀態(tài)的研究應(yīng)著重找尋精準(zhǔn)反映功能變化的分子指標(biāo)，并驗證其與腫瘤相關(guān)VTE的關(guān)系，最終的目的是更精確有效地識別血栓高危人群，進(jìn)行更為精準(zhǔn)個體化治療，包括但不限于抗凝治療、抗血小板治療、抗炎治療及免疫功能調(diào)節(jié)等。