抗中性粒細胞胞漿抗體檢測方法學研究進展

邢娜娜，張娜麗，王文強，孫萌，李忠信

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南鄭州 450016）

抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophilcytoplasmic antibodies,ANCA）于1959年首次在慢性炎癥疾病患者被發(fā)現(xiàn)[1]，但直到1982年血管炎與中性粒細胞胞漿成分反應(yīng)的自身抗體之間的關(guān)系才被明確[2]，人們才意識到ANCA與血管炎相關(guān)。1985年，van der Woude等[3]通過間接免疫熒光的方法在GPA患者中檢測到這種抗細胞質(zhì)抗體，并把這種細胞質(zhì)分布的熒光模型稱為C-ANCA。繼C-ANCA之后，有學者報道了在系統(tǒng)性動脈炎和腎小球腎炎患者中產(chǎn)生核通過IIF方法發(fā)現(xiàn)了圍繞細胞核周染色模式的自身抗體，即P-ANCA[4-5]。之后IIF得到了更多的關(guān)注與應(yīng)用，一度被認為是檢測ANCA的“金標準”。隨著PR3和MPO的發(fā)現(xiàn)，以及蛋白純化技術(shù)的進步，針對抗原特異性的檢測也得到快速發(fā)展，包括酶聯(lián)免疫的一、二、三代產(chǎn)品，免疫印跡、熒光酶免疫分析、化學發(fā)光、聯(lián)合特異性抗原檢測的IIF，以及高通量的多重微珠免疫法等多平臺、多方法學，本綜述將介紹不同的檢測方法及其方法學之間的一致性。

1 ANCA的組成

抗中性粒細胞胞漿抗體是以中性粒細胞及單核細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體，包括人白細胞彈性蛋白酶（human leukocyte elastase,HLE）、乳鐵蛋白（lactoferrin,LF）、蛋白 酶3（proteinase 3,PR3）、彈性蛋白酶（elastase,ELA）、溶酶體（lysozyme,LYS）、髓過氧化物 酶（myeloperoxidase,MPO）、天青殺素（azurocidin,AZU）、組織蛋白酶G（cathepsin G,Cath G）和殺菌/通透性增高蛋（bactericidal/permeability increasing protein,BPI）等。根據(jù)熒光模型，ANCA靶抗原可以分為胞漿型（cytoplasmic ANCA,cANCA）、核周型（perinuclear ANCA,pANCA）和非典 型（atypical ANCA,xANCA）。cANCA的主要靶抗原為PR3，pANCA的主要靶抗原為MPO。PR3是大小29～30KD弱陽性蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員之一。PR3的前體酶經(jīng)過4次加工為成熟形式，主要存在于中性粒細胞的嗜藍顆粒中；其生理抑制劑為α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1-AT）[6]?？筆R3抗體主要見于韋格納肉芽腫，是其特異性抗體，陽性率占70%～80%，且與病程、嚴重性和活動性有關(guān)。MPO是由2條重鏈和2條輕鏈組成的二聚體大分子蛋白，分子量150KD，等電點大于11；其生理抑制劑為銅藍蛋白[7]。pANCA不如cANCA具有診斷特異性，pANCA陽性主要見于特發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎（NCGN）、顯微鏡下多動脈炎（MPA），在GPA患者中也存在抗MPO抗體。pANCA患者的血管炎病變程度重，常有多系統(tǒng)損害。

2 ANCA的檢測方法發(fā)展

隨著檢測技術(shù)的提高，ANCA的檢測方法向多平臺、多原理發(fā)展，常見的檢測方法包括間接熒光法（IIF）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA，第一代、第二代、第三代等）、化學發(fā)光（CLIA）、熒光酶免疫吸附法（FEIA）、多重微珠法等。

2.1 間接免疫熒光 間接免疫熒光（IIF）是檢測ANCA最先使用的手段，一般分為乙醇固定和甲醛固定兩種形式。IIF檢測的特點靈敏度高、特異性差；并且IIF主觀性太強，對結(jié)果的判讀需要很強的專業(yè)知識及豐富的經(jīng)驗。隨著對ANCA研究的深入，越來越多的AAV患者被發(fā)現(xiàn)，檢測工作量增加，對人工閱片要求越高。為了滿足市場的需要，商業(yè)化自動閱片系統(tǒng)上市，比如INOVA公司的NOVA View、Medipan公司的Aklides系統(tǒng)、Immuno Concepts的Image Navigator、Euroimmun AG的EUROPattern等。自動閱片排除了人為的主觀性，滿足了工作量的需求。Knütter I等[8]比較了分別用Aklides系統(tǒng)自動閱片與人工閱片GA公司檢測ANCA的乙醇和甲醇固定玻片，為了使主觀性最小化，由兩位經(jīng)驗豐富的研究者進行手工閱讀，結(jié)果表明自動閱片與人工閱片一致性高。最近又發(fā)展了一種新型檢測技術(shù)即GA公司的CytoBead ANCA[9]，將乙醇固定的中性粒細胞與包被純化的PR3、MPO的珠子共同固定在同一個玻片上，乙醇固定的中性粒細胞位于玻片的中室，包被PR3、MPO的熒光珠子位于右室，其中包被PR3的是9μm的紅色熒光珠子，包被MPO的是15μm的紅色熒光珠子，這種檢測技術(shù)提高了ANCA檢測特異性。

2.2 第一代ELISA自從明確了cANCA、pANCA的靶抗原，一些實驗室從中性粒細胞中純化PR3、MPO蛋白，開始制備抗原特異性檢測[10]。第一個商用ELISA試劑盒于1990年問世[11]，隨后出現(xiàn)了很多ELISA廠家。這些ELISA檢測技術(shù)原理將PR3/MPO蛋白直接物理吸附包被于微孔板中，被稱為第一代ELISA。由于蛋白純化技術(shù)不同，各個廠家檢測結(jié)果差別較大且與IIF結(jié)果缺乏可比性[12]。此外，抗原直接吸附于微孔板造成抗原變形及表位遮掩，導致檢測結(jié)果靈敏度差，造成漏檢。

2.3 第二代、三代ELISA基于第一代ELISAs低敏感性的原因，蛋白質(zhì)修飾新方法和不同的檢測方法快速發(fā)展。所謂的第二代ANCA ELISA檢測使用捕獲分子（主要是抗體）與微孔板結(jié)合，抗原特異性結(jié)合固相上的抗體，這樣可減少抗原的空間位阻，使表位盡可能地暴露，另外減少因抗原與固相直接結(jié)合導致的表位結(jié)構(gòu)改變[13-14]。研究表明[13,15-16]，捕獲法的靈敏度增加，并優(yōu)于直接包被。主要廠家為歐洲診斷。第三代ELISA類似于第二代，為了充分暴露抗原表位，抗原在結(jié)合ELISA板時，利用錨定技術(shù)固定抗原[17-19]。抗原通過附著在ELISA平板表面的錨定分子與ELISA平板表面結(jié)合。與IIF相比，該方法提供了更好的表位可獲得性，從而進一步提高了敏感性和特異性。Roggenbuck D等[19]分別用第一代、第二代、第三代ELISAs檢測86例GPA患者、450例其他疾病和80例健康者，比較三代檢測的特異性和靈敏度并繪制ROC曲線，得到的AUC分別為0.80（第一代，95%置信區(qū)間：0.76～0.83）、0.86（第二代，95%置信區(qū)間：0.82～0.89）和0.96（第三代，95%置信區(qū)間：0.94～0.98）。主要廠家為法迪亞EliA系統(tǒng)。

2.4 其他ELlSA利用直接包被微孔板原理進行PR3 ELISA檢測時，有一種新方法是歐蒙公司開發(fā)的，即使用人天然和重組PR3抗原混合包被[20]。該研究表明[21-22]，這可能比第一代間接法和第二代捕獲法具有更高的靈敏度；然而，這并未在所有的研究中得到證實。

2.5 化學發(fā)光法 上世紀70年代中期，Arakawe首先報道了化學發(fā)光免疫分析（chemiluminescence immunoassay,CLIA），發(fā)展至今已成為一種成熟的、先進的超微量活性物質(zhì)檢測技術(shù)，應(yīng)用范圍廣泛。然而，ANCA化學發(fā)光檢測是近幾年才發(fā)展起來的。國外化學發(fā)光檢測有INOVA的BIO-FLASH系統(tǒng)和A.Menarini公司的Zenit RA系統(tǒng)；國內(nèi)化學發(fā)光廠家主要有蘇州浩歐博、深圳亞輝龍、北京中航賽維、蘇州長光華醫(yī)。以INOVA的QUANTA Flash Lite?為例探討一下化學發(fā)光法：純化的抗原以共價鍵的方式化學連接到磁珠表面的官能團上，加入稀釋后的樣本與磁珠上的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的非特異性抗體；加入帶有標記的二抗孵育，加入底物收集并檢測光信號。一項涵蓋9個國家11個實驗室的大型多中心研究證明，CLIA有高靈敏度和特異性[23]；在另一項研究中使用新開發(fā)的抗MPO抗體CLIA與三種不同的商用MPO檢測法相比，CLIA法有相對較高的敏感性、特異性ROC曲線AUC面積0.96（95%置信區(qū)間：0.90～1.00）[24]；國內(nèi)一項研究比較浩歐博化學發(fā)光與歐蒙ELISA之間的符合率，PR3-ANCA陽性符合率35.1%、陰性符合率96.1%、總符合率86.8%；MPO-ANCA陽性符合率81.9%、陰性符合率98.8%，總符合率93.8%[25]。

2.6 多重微珠免疫法 多重微珠免疫法（bead-based multiplex immunoassays,MBA）采用Luminex技術(shù)，其工作原理為：①編碼微球，用不同配比的兩種熒光染料將直徑5.6μm的聚苯乙烯微球染成不同熒光色，從而獲得多達100種不同熒光編碼的微球；②把針對不同待測物質(zhì)的蛋白以共價交聯(lián)的方式結(jié)合到特定編碼的微球上，每個編碼微球都對應(yīng)相應(yīng)的檢測項目；③把針對不同待測物的熒光編碼微球混合，然后加入待測物，形成的復(fù)合物在與標記熒光素結(jié)合反應(yīng)；④微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的熒光編碼，另一束測定微球上的熒光素的熒光強度。使用多重微珠免疫法檢測ANCA的主要廠家有宙斯（Zeus）的AtheNA Multi-Lyte?和伯樂（Bio-Rad）Bio-Plex?2200。2009年伯樂公司評價Bio-Plex?2200，在一個反應(yīng)里可以同時檢測ANCA三個項目（PR3、MPO、GBM），且具有相對較好的靈敏性和特異性[26]。另一項研究比較了Bio-Plex?2200與INOVA QUNATA Lite，MPO-ANCA符合率為70.4%（n=81；95%置信區(qū)間：59.7%～79.2%），PR3-ANCA符合率為76.5%（n=81；95%置信區(qū)間：66.2%～84.4%）[27]。

2.7 其他方法 除上述方法外，檢測ANCA方法還有斑點/線性免疫印跡法、側(cè)向?qū)游鰴z測（LFA）、可尋址激光珠免疫分析法（ALBIA）等。根據(jù)不同固定及標記工藝，每種方法均有各自特點。

3 總結(jié)

IIF作為發(fā)現(xiàn)ANCA的檢測方法，在早期檢測中占有優(yōu)勢地位，長期以來被人們當作檢測的“金標準”。1999年國際共識中提到疑似ANCA首先用IIF進行篩選，再用抗原特異性檢測確認[28]。由于IIF的特異性差，抗原純化技術(shù)的提高，抗原特異性檢測技術(shù)快速發(fā)展。1990年第一個商業(yè)化ELISA試劑盒上市，即為第一代ELISA。但其特異性好、靈敏度低，漏檢情況嚴重。為解決這一問題，之后自身抗體廠家開發(fā)了“超敏”試劑盒以提高檢出率。1998年以歐洲診斷為主的捕獲法ELISA，2005年以法迪亞為主的熒光酶免疫法（FEIA）、2007年以法迪亞為主的錨定ELISA法、2012年化學發(fā)光法還有最近發(fā)展的多重微珠法等，相比第一代ELISA靈敏度和特異性均有提升。隨著抗原特異性靈敏度的提高，2017年重新修訂了國際共識，共識建議GPA、MPA患者可以直接用高質(zhì)量的特異性檢測ANCA（第二、三代ELISA、化學發(fā)光法、FEIA、多重微珠）[29]。然而，有些實驗室檢測ANCA已經(jīng)排除IIF，其實這是對共識的誤解。

多平臺多方法的聯(lián)合使用，是提高ANCA檢測準確性的必要手段。但由于抗體的異質(zhì)性、各廠家使用的抗原及標記的不同，各個廠家檢測結(jié)果差別較大。盡管美國CDC發(fā)布了參考血清（PR3-ANCA Human Reference Serum #16、MPO-ANCA Human Reference Serum#15），2016年開始也有參考物質(zhì)（MPO：ERM?-DA476/IFCC[30]和PR3：ERM?-DA483/IFCC[31]），可能各廠家的溯源標準不一致，檢測結(jié)果仍然不一致。雖然聯(lián)合檢測是必要手段，但仍不能確定哪種方法、哪個廠家檢測最為科學、準確。目前統(tǒng)一標準是ANCA檢測急需解決的問題。