二甲雙胍通過(guò)SHH 通路對(duì)髓母細(xì)胞瘤抑制機(jī)制的研究進(jìn)展

章鐘鼎，方黃毅，盛漢松

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035

髓母細(xì)胞瘤（medulloblastoma，MB）是兒童常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，占兒童顱內(nèi)腫瘤的10%～20%，15 歲以下兒童年發(fā)病率約為5/100000，成年人偶發(fā)[1]。MB 多發(fā)于后顱窩的小腦蚓部及第四腦室，可導(dǎo)致小腦功能障礙和顱內(nèi)壓升高，患者可出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭痛、行為改變、共濟(jì)失調(diào)和眼球震顫等癥狀。MB 惡性程度高，生長(zhǎng)迅速、易早期轉(zhuǎn)移、術(shù)后易復(fù)發(fā)，總體預(yù)后不佳。通過(guò)手術(shù)、放化療等治療，MB 患者5 年生存率可達(dá)70%～85%，但因長(zhǎng)期接受放化療，患者生存質(zhì)量低下。此外，3歲以下MB 患兒預(yù)后較差，仍是臨床治療的難點(diǎn)。

Hedgehog 信號(hào)通路最早由Nusslein Volhard 和Wieschaus在果蠅中發(fā)現(xiàn)[2]。在哺乳動(dòng)物中，根據(jù)配體不同Hedgehog 被分為Sonic Hedgehog（SHH）、Indian Hedgehog（IHH）和Desert Hedgehog（DHH），其中對(duì)SHH 信號(hào)通路的研究最多。在哺乳動(dòng)物中，SHH 信號(hào)通路參與胚胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的增殖分化及神經(jīng)系統(tǒng)的形成，胚胎期后僅參與部分組織的維持和修復(fù)[3]。SHH 信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致MB 在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生，針對(duì)SHH 信號(hào)通路的抗癌靶向藥也成為目前研究的熱點(diǎn)。

二甲雙胍是一種治療Ⅱ型糖尿病的口服降血糖藥物。早期研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期服用二甲雙胍的Ⅱ型糖尿病人群中乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)病率降低，生存期明顯延長(zhǎng)[4]。隨后，人們發(fā)現(xiàn)其對(duì)包括MB 在內(nèi)的多種腫瘤具有一定療效，其抗癌作用成為研究的熱點(diǎn)。在SHH 型MB 中，二甲雙胍主要通過(guò)激活A(yù)MPK 而直接和間接抑制Gli1 的轉(zhuǎn)錄活性以抑制SHH 信號(hào)通路，對(duì)MB 有潛在的治療作用。

1 SHH 信號(hào)通路在MB 中的異常激活

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，MB 被分為4 種亞型：WNT 型、SHH 型、第3 組型和第4 組型。不同亞型表現(xiàn)出巨大的遺傳學(xué)和生物行為學(xué)差異，為靶向治療提供了依據(jù)。SHH 型約占MB 的30%，發(fā)病率在年齡上呈雙峰分布（多發(fā)于＜5 歲和＞16歲人群），病理上多為經(jīng)典型和促纖維增生／結(jié)節(jié)型MB，5 年生存率約為70%[5]。SHH 通路中的基因異常激活可導(dǎo)致MB的發(fā)生和進(jìn)展。

SHH 信號(hào)通路主要由SHH 配體、膜受體蛋Patched 1（PTCH1）、G 蛋白偶聯(lián)受體樣蛋白（Smoothened，SMO)、融合基因抑制劑（supressor of fused，SUFU）以及核轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli1/2/3 構(gòu)成。SHH 配體是SHH 信號(hào)通路的啟動(dòng)信號(hào)，其轉(zhuǎn)運(yùn)釋放與轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白Disp 有關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制仍未闡明[6]。SHH 配體未與細(xì)胞膜上的PTCH1 結(jié)合時(shí)，PTCH1 抑制SMO進(jìn)入細(xì)胞膜，Gli 就會(huì)被PKA、CK1α 和GSK3β 磷酸化而失去轉(zhuǎn)錄活性，通路處于抑制狀態(tài)；當(dāng)SHH 配體結(jié)合到PTCH1 時(shí)，PTCH1 對(duì)SMO 的抑制作用被解除，SMO 被GPRK2 和CKI 磷酸化并與SUFU 結(jié)合，使全長(zhǎng)Gli 進(jìn)入細(xì)胞核，SHH 信號(hào)通路被激活[7]。Gli 蛋白在核內(nèi)可通過(guò)調(diào)節(jié)各種基因的轉(zhuǎn)錄而在機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育以及癌癥中發(fā)揮重要作用：Gli 可以作為核轉(zhuǎn)錄因子正性調(diào)控Cyclin D1/D2 和MYC、Blc-2 等癌基因，促進(jìn)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌癥發(fā)生；可調(diào)節(jié)Sox2 和Nanog 的表達(dá)介導(dǎo)干細(xì)胞的自我更新；還可以通過(guò)上調(diào)血管生成素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)促進(jìn)血管生成[8]。此外，Gli 調(diào)控的靶基因還包括PTCH 和Gli1，可形成SHH 信號(hào)通路的反饋調(diào)節(jié)。Gli 1/2/3 的作用略有差異，其具體機(jī)制差異尚未被完全闡明，目前針對(duì)Gli 1 的研究最多，相比Gli 2 和Gli 3 其在癌癥中似乎表現(xiàn)出更為重要的作用。

正常情況下SHH 信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中必不可缺，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化以及神經(jīng)管、牙齒、中軸骨和四肢的形成，在胚胎發(fā)育階段后僅參與部分組織的維持和修復(fù)[3]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，SHH 信號(hào)通路主要在胚胎期調(diào)控小腦發(fā)育，但若在胚胎期后異常激活則可導(dǎo)致MB 的發(fā)生，其異常激活與PTCH1、SUFU、SMO 基因的失活突變以及Gli1/2 基因的激活有關(guān)[1]。其中，PTCH1 的失活突變是導(dǎo)致SHH 型MB 的最常見(jiàn)原因（占SHH 型MB 的43%，占所有MB 的30%），其失活可導(dǎo)致對(duì)SMO 的抑制作用解除，從而使SHH 信號(hào)通路被激活。此外，TP53 突變?cè)贛B 中較為常見(jiàn)，與其他亞型的MB 不同的是TP53 突變的SHH 型MB 往往預(yù)后較差，因此WHO 又將SHH 型MB 分為T(mén)P53 突變組和TP53 野生組兩種亞組。在細(xì)胞層面上，最近有研究發(fā)現(xiàn)OLIG2+祖細(xì)胞是SHH 型MB 的起始瘤細(xì)胞，OLIG2+表達(dá)過(guò)度者預(yù)后不佳[9]。

2 當(dāng)前針對(duì)SHH 信號(hào)通路的靶向藥物

針對(duì)SHH 通路的藥物有SMO 抑制劑、Gli 抑制劑和SHH配體抑制劑。SMO 抑制劑研究最多，一般通過(guò)結(jié)合SMO 阻止其構(gòu)象改變而阻止SHH 通路激活。目前已有維莫德吉（vismodegib，GDC-0449）、索尼吉步（sonidegib，NVP-LDE225）和格拉吉布（glasdegib，PF-04449913）被批準(zhǔn)上市。維莫德吉和索尼吉步被批準(zhǔn)用來(lái)治療晚期基底細(xì)胞癌，也被用于MB的治療。但在MB 的治療中，兩者都因SMO 突變較為普遍而表現(xiàn)出嚴(yán)重的耐藥性（如維莫德吉對(duì)D473H、E518K 型SMO突變患者無(wú)效），且存在疲勞、惡心、體重減輕和味覺(jué)喪失等不良反應(yīng)。格拉吉布則用于治療急性髓細(xì)胞性白血病。

SHH 配體抑制劑和Gli 抑制劑尚處于起步階段，它們分別處于SHH 信號(hào)通路的始端和末端，解決了SMO 抑制劑因SMO 基因突變而產(chǎn)生的耐藥性。其中，Gli 作用于下游癌基因，其轉(zhuǎn)錄水平和SHH 型MB 患者的預(yù)后負(fù)相關(guān)，是目前研究的熱點(diǎn)。Gli 抑制劑GANT61、GANT58、FN1-8、pyrvinium（FDA 批準(zhǔn)作為驅(qū)蟲(chóng)藥）和三氧化二砷（ATO）（FDA 批準(zhǔn)用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。┑纫言谂R床前研究中有較好的表現(xiàn)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在MB 中GANT61 能夠通過(guò)抑制GLI1 轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)CyclinD1 的表達(dá)，抑制MB 細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[11]。此外，pyrvinium 也被證實(shí)可通過(guò)破壞Gli 蛋白穩(wěn)定性來(lái)抑制MB 增殖，其與SMO 抑制劑聯(lián)合使用可延緩耐藥性產(chǎn)生且療效更佳[12]。ATO 在MB 治療中的前景亦受到部分學(xué)者關(guān)注。SHH 配體抑制劑的研究則較少，目前僅有RU-SKI 43 和5E1 處于臨床前研究階段。

3 二甲雙胍對(duì)MB 的潛在抑癌作用機(jī)制

二甲雙胍是作為降血糖藥物，可增加細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，并通過(guò)激活A(yù)MPK 等通路，發(fā)揮抑制肝葡萄糖輸出、促進(jìn)骨骼肌攝取葡萄糖以及抑制腸道吸收葡萄糖等作用。目前認(rèn)為二甲雙胍的抑癌作用也主要通過(guò)AMPK 途徑，在結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、黑色素瘤、肺癌、子宮內(nèi)膜癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，二甲雙胍表現(xiàn)出良好的療效[13]。在MB 中，二甲雙胍可直接或間接激活A(yù)MPK 信號(hào)通路，發(fā)揮AMPK 信號(hào)通路對(duì)SHH 信號(hào)通路中Gli 蛋白轉(zhuǎn)錄的抑制作用，從而抑制下游癌基因表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

AMPK 是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白酶異源三聚體，由α-催化亞基、β-調(diào)節(jié)亞基和γ-調(diào)節(jié)亞基組成，在進(jìn)化上高度保守。α-亞基上第172 號(hào)蘇氨酸殘基的磷酸化是AMPK 的啟動(dòng)信號(hào)，AMP／ATP 比值升高、鈣離子濃度升高以及一些小分子物質(zhì)的直接作用都可以促進(jìn)AMPK 通路的激活[14]。激活的AMPK 通路可以增加分解代謝并降低合成代謝，從而維持能量平衡；同時(shí)，AMPK 可調(diào)節(jié)下游與腫瘤相關(guān)的通路（如mTOR 和SHH 等），發(fā)揮抑癌作用。二甲雙胍主要通過(guò)線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體I 的電子傳遞，阻止ATP 生成，使AMP／ATP 比值升高，從而間接激活A(yù)MPK 信號(hào)通路[15]；二甲雙胍也可通過(guò)直接磷酸化AMPKα-催化亞基上的第172 號(hào)蘇氨酸殘基以及結(jié)合γ-調(diào)節(jié)亞基以激活A(yù)MPK 信號(hào)通路[16]。

Gli 是SHH 通路的重要末端分子，Gli1／2 轉(zhuǎn)錄活躍的SHH 型MB 患者往往預(yù)后不佳。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)Gli1／2 進(jìn)行拮抗可抑制MB 細(xì)胞增殖[17]。二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK 而直接和間接抑制Gli1 的轉(zhuǎn)錄活性，從而下調(diào)SHH 信號(hào)通路的下游CyclinD1、Caspase-3 和Caspase-9 等與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。Li 等[18]發(fā)現(xiàn)，在MB 中，AMPK 可以磷酸化Gli1蛋白的第102 號(hào)、408 號(hào)絲氨酸殘基和第1074 號(hào)蘇氨酸殘基，降低Gli1 的穩(wěn)定性和表達(dá)水平，從而阻斷SHH 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄活性，但并不降解Gli1；Di Magno 等[19]則認(rèn)為AMPK 通過(guò)磷酸化Gli1 的408 號(hào)絲氨酸殘基直接發(fā)揮降解Gli1 的作用。此外，AMPK 可以抑制雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）的表達(dá)。mTORC1 可磷酸化核糖體p70S6 激酶蛋白（SK61）和真核起始因子4E 結(jié)合蛋白1（4E-BP1），還可調(diào)節(jié)PI3K／Akt 和RAS-Raf-MAPK 等信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。研究表明mTOR 信號(hào)通路也可促進(jìn)Gli1 的表達(dá)[21]，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK 抑制mTOR 信號(hào)通路，從而間接抑制SHH 信號(hào)通路。最近Elgendy等[22]發(fā)現(xiàn)小鼠在禁食狀態(tài)下聯(lián)合使用二甲雙胍可激活GSK3β從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。GSK3β 的激活可促進(jìn)Gli 的磷酸化從而抑制SHH 信號(hào)通路的激活，或許也是二甲雙胍可抑制MB 的潛在機(jī)制之一。目前細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)二甲雙胍在胰腺癌、胃癌和乳腺癌中可以顯著下調(diào)PTCH1、SMO 和Gli1 等SHH 通路標(biāo)志物的表達(dá)[23,24]。此外，Gonnissen 等[25]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用二甲雙胍和GANT61 處理前列腺癌細(xì)胞可以更好地降低SHH 通路的激活，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并增加其對(duì)放療的敏感性。這提示二甲雙胍與其他SHH 通路靶向藥聯(lián)合使用存在更好的療效。

二甲雙胍還可為MB 的治療帶來(lái)其他效益。如二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK 通路磷酸化p53 蛋白的15 號(hào)絲氨酸殘基從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，這或許可以改善TP53 突變的SHH 型MB 的預(yù)后。二甲雙胍可以改善代謝狀況、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)激活、改善腸道微生態(tài)，從而抑制腫瘤細(xì)胞繁殖。此外，還有研究表明二甲雙胍可以減輕膠質(zhì)瘤引起的腦水腫，對(duì)MB 的治療亦有積極意義[26]。

4 二甲雙胍對(duì)MB 的治療前景

二甲雙胍作為治療2 型糖尿病的降糖藥問(wèn)世多年，其安全性已得到廣泛驗(yàn)證，其對(duì)于多種腫瘤的抑制作用也在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床研究中被證實(shí)。在SHH 信號(hào)通路中，二甲雙胍作用的Gli 處于通路的末端，對(duì)其進(jìn)行抑制也可解決上游PTCH1、SMO、SUFU 等基因突變?cè)斐傻腟HH 信號(hào)通路異常，克服MB 對(duì)現(xiàn)有SMO 抑制劑產(chǎn)生的耐藥性，具有更廣的適用范圍。臨床前研究已證實(shí)二甲雙胍對(duì)SHH 通路異常的胰腺癌、胃癌和乳腺癌具有良好的療效；與其藥理作用相似的雙胍類(lèi)降糖藥苯乙雙胍在SHH 型MB 的研究中也表現(xiàn)出良好的效果[27]。此外，研究表明小鼠口服二甲雙胍后腦組織中活化的AMPK 增多，說(shuō)明二甲雙胍可穿過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用[28]。二甲雙胍在MB 的治療中具有光明的前景，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。