LC-MS/MS檢測尿液類固醇激素在疾病研究中的應(yīng)用

張瀟莉，楊娜，葛佳佳，朱懷軍，何駿，葛衛(wèi)紅，*（.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 0008；.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 0008）

類固醇激素是一類由膽固醇經(jīng)一系列酶催化代謝產(chǎn)生的脂溶性小分子化合物，主要包括性激素和皮質(zhì)激素。內(nèi)源性類固醇激素的變化在內(nèi)分泌疾病及相關(guān)代謝性疾病的篩查與診斷中具有重要參考價(jià)值，其精確定量分析對(duì)于臨床研究是十分必要的。目前，臨床常用檢測類固醇激素的方法主要是免疫分析法，但隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)的不斷發(fā)展，其因高通量、高靈敏度和高特異性，適用范圍廣、檢測周期短，并且具有同時(shí)定性定量分析多種激素的優(yōu)勢，已逐漸替代免疫分析方法，成為臨床檢測與疾病篩查及診斷中重要的新技術(shù)。

與血清、血漿樣本相比，尿液樣本可以被非侵入性地連續(xù)收集，患者更易接受，且尿液前處理相對(duì)簡單。尿液排泄作為人體排泄的重要途徑，尿液中涵蓋大量內(nèi)源性極性代謝產(chǎn)物。通過對(duì)尿液樣本進(jìn)行定量，可提供一個(gè)較為完整的代謝概況。例如，24 h尿兒茶酚胺的結(jié)果可比血兒茶酚胺更加精準(zhǔn)地反映交感神經(jīng)和腎上腺髓質(zhì)的功能。臨床診斷庫欣綜合征時(shí)，24 h尿游離皮質(zhì)醇能夠避免皮質(zhì)醇的瞬時(shí)變化，避免血中皮質(zhì)醇結(jié)合球蛋白濃度改變而影響皮質(zhì)醇測定結(jié)果，且在大劑量地塞米松抑制試驗(yàn)中24 h尿游離皮質(zhì)醇對(duì)庫欣綜合征診斷的靈敏度和特異性都高于血皮質(zhì)醇。5-羥吲哚乙酸的定量檢測可用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤患者的監(jiān)測和診斷，雖然其可以在血樣中被定量分析，但臨床通常采用尿液樣本進(jìn)行檢測。因此，利用LC-MS/MS技術(shù)檢測尿液樣本中的內(nèi)源性物質(zhì)具有一定優(yōu)勢，且已成為臨床檢測的一個(gè)重要方向。本文主要就LC-MS/MS技術(shù)在尿液類固醇激素測定中的研究及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 基于LC-MS/MS技術(shù)的尿液類固醇激素定量方法的研究現(xiàn)狀

LC-MS/MS技術(shù)是一種結(jié)合液相色譜與質(zhì)譜的定性和定量的分析技術(shù)。該技術(shù)具有液相色譜的高效分離性能和串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高特異性檢測的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多種成分的同時(shí)測定，適用于血清、尿液等復(fù)雜生物樣本的分析檢測。目前，利用LC-MS/MS技術(shù)在尿液中檢測內(nèi)源性類固醇激素正在迅速發(fā)展，其前處理不斷優(yōu)化，靈敏度不斷提高，檢測數(shù)量也逐漸增多。

尿液中涵蓋大量的內(nèi)源性極性代謝產(chǎn)物，在分析檢測前通常需要進(jìn)行前處理以去除干擾性小分子。常用的前處理方法主要有蛋白質(zhì)沉淀法、液液萃取法和固相萃取法，但上述方法均存在操作時(shí)間長，處理步驟復(fù)雜等缺點(diǎn)。隨著尿液前處理方法的不斷優(yōu)化，出現(xiàn)并行樣品處理、柱交換和在線固相萃取等技術(shù)。這些技術(shù)可提高檢測靈敏度，增加檢測種類，縮短處理時(shí)間，提高效率且不影響檢測質(zhì)量，已在生物分析應(yīng)用中獲得認(rèn)可。例如Naldi等開發(fā)并驗(yàn)證了一種基于全自動(dòng)的在線固相萃取進(jìn)行樣品提取和定量的LCMS/MS法，能同時(shí)檢測尿液和水樣中多種類固醇激素，分離分析只需10 min，節(jié)省大量時(shí)間并減少流程錯(cuò)誤。Son等建立了一種新的LC-MS/MS方法，使用

β

-葡萄糖醛酸苷酶和固相萃取進(jìn)行處理并提取，可用于檢測和分析尿液中的39種類固醇激素。

新色譜技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了LC-MS/MS技術(shù)檢測類固醇激素的發(fā)展，例如超高效液相色譜法（UPLC）、整體色譜法及親水相互作用色譜法等，不僅能提供更高的靈敏度和分離效率，運(yùn)行時(shí)間縮短，同時(shí)能最大限度地減少基質(zhì)效應(yīng)。傳統(tǒng)色譜柱采用3 μm或5 μm的顆粒進(jìn)行填充，而超高效液相色譜法的引入使高效小顆粒色譜柱應(yīng)用于檢測，其通常填充＜2 μm的顆粒。與傳統(tǒng)色譜柱相比，高效小顆粒色譜柱能提供更高的穩(wěn)定性，減少溶劑使用量，增加靈敏度。如Zhou等采用UPLC-ESI-MS法同時(shí)檢測尿液樣本中14種類固醇激素，該方法經(jīng)過全面驗(yàn)證，各激素提取回收率均大于87%，靈敏度更高。Dmitrieva等利用UPLC-HRMS技術(shù)檢測9種尿類固醇激素，采用分散液液微萃取法提取，該方法容易操作且不需大量有毒有機(jī)溶劑。

質(zhì)譜電離技術(shù)的發(fā)展可以提高LC-MS/MS技校檢測的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。其中大氣壓光化學(xué)電離技術(shù)作為大氣壓化學(xué)電離、電噴霧電離技術(shù)的補(bǔ)充，是更具有選擇性，在類固醇激素分析中展現(xiàn)出優(yōu)勢，能減少基質(zhì)效應(yīng)、提高靈敏度，但電噴霧電離技術(shù)在檢測尿類固醇激素方面的應(yīng)用更廣泛，其與三重四極桿儀相結(jié)合測定類固醇激素有著更高的靈敏度與特異性，且化學(xué)衍生化可以提高類固醇激素的電離效率，提高靈敏度，并有助于適合的監(jiān)測模式。如Berg等開發(fā)建立的LC-ESI-MS/MS法可檢測尿液中27種雌激素相關(guān)代謝物，該方法經(jīng)過驗(yàn)證，定量檢測靈敏度可達(dá)到pg級(jí)。Dai等建立了新的LCESI-MS/MS法，使用氘4-（二甲氨基）-苯甲酸衍生化試劑，提高電離效率與檢測靈敏度，能檢測到24種尿類固醇激素。

綜上，樣品前處理的優(yōu)化，色譜條件的發(fā)展，靈敏準(zhǔn)確的質(zhì)譜儀都在加快LC-MS/MS技術(shù)的發(fā)展，也使尿液類固醇激素的檢測有了更大的進(jìn)步。這些應(yīng)用均表明LC-MS/MS技術(shù)具有準(zhǔn)確可靠的多分析物分析的潛力。

2 尿液類固醇激素檢測的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展

2.1 皮質(zhì)激素

皮質(zhì)激素來源于腎上腺皮質(zhì)，包括糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，其在許多生理過程中起到至關(guān)重要的作用。皮質(zhì)激素代謝的改變是引起鹽皮質(zhì)激素過多綜合征、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥和腎上腺功能不全的原因。研究發(fā)現(xiàn)，庫欣綜合征、多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能亢進(jìn)、妊娠高血壓、先兆子癇及抑郁癥等疾病也與體內(nèi)這種改變有關(guān)。

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥是一種常染色體隱性疾病，體內(nèi)21羥化酶缺乏會(huì)導(dǎo)致皮質(zhì)醇和醛固酮合成受阻，兩者體內(nèi)代謝的改變引起疾病的發(fā)生。利用LC-MS/MS法對(duì)尿液中的皮質(zhì)醇及其代謝物進(jìn)行定量分析，可有效降低診斷假陽性率，提高篩查診斷準(zhǔn)確性。如Pussard 等建立的LC-MS/MS法成功檢測尿液中內(nèi)源性皮質(zhì)醇、雄激素及17-羥孕酮等，其結(jié)果可用于診斷先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥，并能應(yīng)用于患者激素替代治療的定期監(jiān)測。Kosicka等利用新建立的LC-MS/MS法對(duì)尿皮質(zhì)醇和可的松及其代謝物進(jìn)行定量，該方法經(jīng)過充分驗(yàn)證，符合歐洲藥品管理局的要求，可用于先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、庫欣綜合征等臨床樣本的分析。

人體內(nèi)缺乏11

β

-羥基類固醇脫氫酶，無法將皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)化為皮質(zhì)酮，導(dǎo)致皮質(zhì)醇在體內(nèi)蓄積而引起庫欣綜合征。24 h尿游離皮質(zhì)醇是皮質(zhì)醇綜合分泌的指標(biāo)，也是庫欣綜合征的合理篩查標(biāo)志物。靈敏準(zhǔn)確的LC-MS/MS法檢測尿游離皮質(zhì)醇對(duì)于庫欣綜合征的篩查診斷十分有利。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，通過LC-MS/MS法測定的24 h尿游離皮質(zhì)醇在臨床實(shí)踐中具有優(yōu)越的診斷性能，其準(zhǔn)確度與內(nèi)分泌學(xué)會(huì)指南建議的診斷方法的準(zhǔn)確度相同，這表明測定24 h尿游離皮質(zhì)醇能夠更加方便準(zhǔn)確地鑒別庫欣綜合征。例如，Ceccato等建立了標(biāo)準(zhǔn)化的LC-MS/MS分析方法測定尿液中游離皮質(zhì)醇的濃度，并評(píng)估該方法用于診斷庫欣綜合征的靈敏度及特異性，通過實(shí)驗(yàn)得到了庫欣綜合征患者不同發(fā)病階段的皮質(zhì)醇水平參考范圍，該范圍為庫欣綜合征的對(duì)癥治療提供了一些參考。LC-MS/MS法可以避免免疫分析法檢測皮質(zhì)醇時(shí)的干擾問題。LC-MS/MS法在尿液中檢測皮質(zhì)醇的假陰性率較免疫分析法低，能更加方便、快速地獲得結(jié)果。Bianchi等利用LC-MS/MS法檢測庫欣綜合征患者的尿液樣本，其皮質(zhì)醇檢測結(jié)果能滿足臨床醫(yī)師對(duì)患者實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的要求，且準(zhǔn)確度更高。因此，利用LC-MS/MS法檢測尿液皮質(zhì)激素在體內(nèi)水平的變化，對(duì)庫欣綜合征的篩查與診斷十分有利。慢性壓力和重度抑郁癥與皮質(zhì)醇代謝有關(guān)，為了更好地了解抑郁癥，Zhai等利用LC-MS/MS法定量分析健康成人和抑郁癥患者尿液中的5種皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇、可的松、四氫皮質(zhì)醇、異源四氫皮質(zhì)醇和四氫可的松），結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素水平在抑郁癥患者中產(chǎn)生了顯著變化，并發(fā)現(xiàn)了患者體內(nèi)11

β

-羥基類固醇脫氫酶Ⅱ型活性降低，5

α

-還原酶途徑出現(xiàn)功能障礙。體內(nèi)皮質(zhì)醇代謝的變化以及酶活性的改變?yōu)閷ふ乙钟舭Y的潛在病因提供了新的想法。多囊卵巢綜合征與雄激素和皮質(zhì)醇代謝物排泄增強(qiáng)以及5

α

-還原酶活性增加有關(guān)，皮質(zhì)激素生成增多是其重要的致病途徑。Cuzzola等基于新開發(fā)的LC-MS/MS法測定多囊卵巢綜合征患者的游離總糖皮質(zhì)激素，激素定量分析結(jié)果可用于支持與皮質(zhì)醇代謝相關(guān)病理的臨床診斷。

上述疾病均可以通過監(jiān)測皮質(zhì)醇、可的松及相關(guān)代謝物在體內(nèi)的水平變化來篩查診斷，因此利用靈敏、準(zhǔn)確、高效的LC-MS/MS法用于檢測尿液皮質(zhì)激素水平變化，對(duì)先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、庫欣綜合征等疾病進(jìn)行方便篩查、及早診斷與治療十分重要。

2.2 性激素

2.2.1 雌激素 雌激素是體內(nèi)常見的甾體類固醇激素，包括雌酮、雌二醇、雌三醇等，主要由卵巢產(chǎn)生，也可由雄激素經(jīng)芳香化轉(zhuǎn)化產(chǎn)生。雌激素具有廣泛而重要的生理作用，不僅作用于女性生殖系統(tǒng)，而且對(duì)內(nèi)分泌、心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、皮膚及附屬物等均有明顯的影響。內(nèi)源性雌激素的定量分析在多種疾病的診斷治療中至關(guān)重要，包括女性生殖器模糊、多囊卵巢綜合征、卵巢癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌等。最近的研究發(fā)現(xiàn)雌激素及代謝物在女性盆底功能障礙性疾病，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如阿爾茨海默病、帕金森病），骨質(zhì)疏松等骨骼疾病以及糖尿病等疾病病因解釋中起到很大作用。

考慮到兒童和老年人體內(nèi)雌激素濃度較低，臨床診斷和流行病學(xué)研究都需要高靈敏度和高特異性的方法，且檢測樣本應(yīng)具有方便采集、非侵入性特點(diǎn)，為此研究者們進(jìn)行了一系列研究。例如，Coburn等利用LC-MS/MS法檢測血清、血漿和尿液中雌激素水平，該研究發(fā)現(xiàn)血清和尿液中雌激素及其代謝物測定值之間具有一致性，且單個(gè)代謝物的尿液濃度與血清濃度相關(guān)，并證明了尿液和血清中雌激素圖譜的一致性，結(jié)果證實(shí)尿液是流行病學(xué)研究中的一種適合替代物。Faupel等對(duì)比了LC-MS/MS法、放射性免疫分析法和酶相關(guān)免疫吸附劑檢測法測定尿液中雌激素及代謝物水平，其結(jié)果表明LC-MS/MS法更適合于測定絕經(jīng)后女性的雌激素及代謝物絕對(duì)或相對(duì)數(shù)量或水平變化，還能更全面地了解雌激素代謝物的特征。綜上，與血清相比，尿液中雌激素的濃度相對(duì)較高，并且其采集是無創(chuàng)性的，參與研究者更容易接受。因此，選擇尿液樣品測定雌激素及其代謝物具有明顯優(yōu)勢。

對(duì)雌激素及其代謝物進(jìn)行定量分析對(duì)于闡明其致癌機(jī)制以及在子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌的早期診斷、篩查、預(yù)防和治療領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用具有重要意義。例如，Zhao等利用LC-MS/MS法檢測子宮內(nèi)膜癌患者與健康女性尿液中7種內(nèi)源性雌激素代謝物（2-羥基雌二醇、2-羥基雌酮、4-羥基雌二醇、4-羥基雌酮、16

α

-羥基雌二酮、2-甲氧基雌二醇和2-甲氧基雌酮），發(fā)現(xiàn)與健康女性相比，子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)4-羥基雌二醇增多，2-甲氧基雌酮和2-甲氧基雌二醇減少，其中4-羥基雌二醇在體內(nèi)的高表達(dá)可能成為子宮內(nèi)膜癌高危人群的篩查指標(biāo)。這為子宮內(nèi)膜癌患者尿液生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了獨(dú)特的見解，為子宮內(nèi)膜癌的早期篩查提供了新的方法，該結(jié)果還需要廣大研究者進(jìn)一步研究確認(rèn)。

乳腺癌患者體內(nèi)雌激素代謝物同樣失衡。Berg等建立了一種新的LC-MS/MS法在極少量尿液中檢測27種雌激素及其代謝物，對(duì)該方法進(jìn)行充分驗(yàn)證后用于檢測乳腺癌患者的尿雌激素及代謝物濃度。結(jié)果表明內(nèi)源性雌激素代謝的不平衡與乳腺癌發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，這為臨床尋找評(píng)估乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的潛在生物標(biāo)志物，盡快實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)和治療乳腺癌提供了新的思路。這些研究對(duì)于加快LC-MS/MS法應(yīng)用于臨床檢測提供了更加令人信服的證據(jù)。闡明雌激素及其代謝物在體內(nèi)的變化特征對(duì)于上述疾病的臨床研究與診斷十分關(guān)鍵，因此，利用準(zhǔn)確特異的LC-MS/MS法來評(píng)估體內(nèi)雌激素及代謝物濃度有利于及早發(fā)現(xiàn)各種疾病，進(jìn)而進(jìn)行積極有效的臨床干預(yù)。

2.2.2 雄激素 雄激素又稱為男性激素，包括睪酮、二氫睪酮、雄烯二酮等，主要是由睪丸合成和分泌，腎上腺和卵巢也分泌少量。其主要功能為促進(jìn)男性性器官與精子發(fā)育成熟，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，加快骨骼肌生長，抑制體內(nèi)脂肪增加等。人體內(nèi)雄激素代謝紊亂會(huì)引起肥胖、代謝綜合征、2型糖尿病和骨質(zhì)疏松，也會(huì)增加心血管、腦血管（如中風(fēng)和短暫性缺血發(fā)作）和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。監(jiān)測尿液雄激素代謝物水平變化對(duì)于研究激素替代療法對(duì)骨質(zhì)疏松癥和性腺功能減退的影響以及前列腺癌等癌癥早期預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物十分重要。

人體內(nèi)5

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-還原酶可催化睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮，當(dāng)二氫睪酮在前列腺和皮膚內(nèi)積累到一定程度，會(huì)引起許多病理改變，如前列腺增生癥、痤瘡、女性多毛、男性脫發(fā)等。進(jìn)一步明確雄激素水平變化與不同疾病之間的關(guān)系，有助于及早預(yù)防并對(duì)癥治療。例如，Im等通過監(jiān)測尿液內(nèi)源性雄激素濃度研究非那雄胺治療脫發(fā)的療效，其開發(fā)建立一種高靈敏度高特異性的LCMS/MS法，同時(shí)定量分析尿雄激素和前列腺素，并測定男性脫發(fā)組和正常對(duì)照組患者尿液中兩種激素的濃度差異，從而分析該藥物的治療效果。該定量分析方法在雄激素代謝相關(guān)的炎癥疾病中的應(yīng)用也具有巨大潛力。

精確檢測內(nèi)源性雄激素有助于我們進(jìn)一步了解并更好地治療代謝紊亂。對(duì)此，Wang等開發(fā)了同時(shí)量化尿液中15種類固醇激素葡萄糖醛酸苷的LC-MS/MS法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿液中脫氫表雄酮排泄增加后，患者開始出現(xiàn)腎上腺功能亢進(jìn)癥狀（如多毛、脫發(fā)、痤瘡、高血壓等），這一發(fā)現(xiàn)為腎上腺功能亢進(jìn)的早期鑒別診斷提供了新的思路，加快了臨床尿液樣本檢測雄激素及其代謝物的進(jìn)展，也為腎上腺功能亢進(jìn)與多囊卵巢綜合征區(qū)分鑒別提供了思路。多囊卵巢綜合征患者體內(nèi)睪酮和孕酮增多，產(chǎn)生與腎上腺功能亢進(jìn)相似癥狀，僅通過臨床癥狀無法準(zhǔn)確鑒別，因此對(duì)疑似人群進(jìn)行內(nèi)源性雄激素和孕激素定量檢測，有助于該疾病的鑒別診斷。利用LC-MS/MS技術(shù)對(duì)多囊卵巢綜合征患者尿液中睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮等雄激素進(jìn)行定量能將多囊卵巢綜合征與其他疾病區(qū)分開，提高診斷準(zhǔn)確性。

有研究表明，類固醇激素如硫酸和葡萄糖醛酸的結(jié)合形式，在尿液中的濃度要比血漿或血清中的更高。內(nèi)源性雄激素硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合物可作為控制興奮劑濫用的指標(biāo)。因此，Strahm等開發(fā)了一種快速靈敏的LC-MS/MS法，用于同時(shí)分離和量化尿睪酮、還原膽烷醇酮及脫氫表雄酮等的硫酸和葡萄糖醛酸結(jié)合物，該方法適用于檢測運(yùn)動(dòng)員尿液中雄激素結(jié)合物，以檢驗(yàn)其是否服用興奮劑。尿液的快速獲取與簡單處理縮短了獲知檢測結(jié)果的時(shí)間，因此，采用LC-MS/MS法檢測尿液中雄激素水平是大型賽事的最佳選擇。

3 總結(jié)與展望

目前，LC-MS/MS法已成為臨床實(shí)驗(yàn)室用于臨床疾病診斷標(biāo)志物測定的有力武器之一。深入了解人體內(nèi)源性類固醇激素的變化將有助于更好地篩查和診斷相關(guān)疾病。LC-MS/MS法因其高靈敏度和高特異性等特點(diǎn)，使同時(shí)監(jiān)測多種內(nèi)源性物質(zhì)成為可能，在多種內(nèi)分泌和代謝疾病的早期診斷和監(jiān)測中具有重要意義。利用準(zhǔn)確特異的LC-MS/MS法檢測尿液樣本中類固醇激素能全面闡述其整體代謝輪廓，也使研究者們更加關(guān)注尿類固醇激素與臨床疾病的關(guān)聯(lián)。本文中提及的方法均經(jīng)過充分驗(yàn)證，但較多研究在臨床相關(guān)疾病診療中的實(shí)際應(yīng)用還需在大規(guī)模人群中驗(yàn)證，且方法提供的參考價(jià)值等問題有待進(jìn)一步確定。LC-MS/MS技術(shù)測定尿類固醇激素正在發(fā)展中，很多色譜、質(zhì)譜技術(shù)并未應(yīng)用檢測，本綜述僅簡要介紹了近年來應(yīng)用于檢測尿類固醇激素的方法。由于LC-MS/MS技術(shù)檢測尿液樣本中內(nèi)源性孕激素的研究極少，且未應(yīng)用于臨床，因此本文并未涵蓋所有類固醇激素，尿液孕激素的檢測未過多闡述。相信隨著LC-MS/MS技術(shù)檢測尿液類固醇激素的不斷完善，研究者們將開發(fā)建立更多方法用于檢測尿液中的所有類固醇激素，為內(nèi)分泌及代謝相關(guān)疾病尋找潛在的生物標(biāo)志物，加快LC-MS/MS技術(shù)檢測尿液類固醇激素在臨床中的應(yīng)用。