榆耳、桑黃天然復(fù)合防腐劑的研制

穆淑媛 龐獻(xiàn)偉 李冬梅 韓秀

（泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院 山東泰安 271000）

關(guān)鍵字 榆耳；桑黃；天然復(fù)合防腐劑；抑菌

1 前言

榆耳、桑黃均為名貴食、藥用菌，在我國(guó)具有較長(zhǎng)的入藥歷史。榆耳（Gloeostereum incamatum），學(xué)名肉紅膠韌革菌，民間常用榆耳水煎液治療腸炎、痢疾、腹瀉[1]等疾??；桑黃（Sanghuangporus sanghuang）的藥用價(jià)值最早記載于李時(shí)珍的《本草綱目》中，是國(guó)際認(rèn)同的抗腫瘤效果較好的一種藥用真菌[2]。除了常見(jiàn)報(bào)道的抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化作用外，其抑菌活性也逐漸被關(guān)注。有研究[3-6]表明，榆耳、桑黃的單一提取物或發(fā)酵液對(duì)痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌等具有明顯的抑制作用。但對(duì)于榆耳和桑黃復(fù)合提取物的抑菌效果未見(jiàn)報(bào)道。

天然防腐劑具有安全無(wú)毒、抗菌效果好、作用范圍廣等化學(xué)防腐劑不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，正逐步替代化學(xué)類防腐劑，市場(chǎng)前景廣闊[7]。目前對(duì)動(dòng)物源、植物源和微生物源的天然防腐劑報(bào)道比較多，對(duì)食用菌源的研究較少。

單一的天然防腐劑抑菌譜窄、抑菌能力有局限性、使用量大，多種天然防腐劑適當(dāng)復(fù)配，不僅能降低防腐劑的使用量，還能明顯拓寬抑菌譜、提高抑菌效果[8]。因此本研究將榆耳、桑黃子實(shí)體提取物復(fù)配并研究其抑菌性，旨在為開(kāi)發(fā)一種用于食品防腐的天然復(fù)合防腐劑做部分基礎(chǔ)工作。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

榆耳、桑黃子（泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院）；大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（上海保藏生物技術(shù)中心）；PDA培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)室配制）。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 榆耳水提液制備

將榆耳子實(shí)體在60℃條件下烘干稱重，加入30倍去離子水；浸泡24 h，沸水提取2 h；經(jīng)4層紗布過(guò)濾，對(duì)濾出的殘?jiān)M(jìn)行二次提取；合并2次濾液，減壓過(guò)濾并濃縮蒸干，即為榆耳水提物。水提物加入無(wú)菌水，分別配置成濃度為1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL的水提液，備用。

2.2.2 桑黃水提液制備

將桑黃子實(shí)體在60℃條件下烘干，粉碎至0.5 cm3以下顆粒狀，稱重；加入30倍去離子水，沸水提取2 h；之后處理同2.2.1。

2.2.3 細(xì)菌抑制試驗(yàn)

結(jié)合雙層平板法及杯碟法進(jìn)行測(cè)定[9]。將細(xì)菌活化，之后接種于液體肉湯培養(yǎng)基；37℃條件下振蕩培養(yǎng)16 h，調(diào)節(jié)菌液濃度至106cfu/mL，備用；將下層培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，待其凝固后，取1 mL菌液混入；置于9 mL培養(yǎng)基中，冷卻至約45℃；立即傾倒覆蓋于下層培養(yǎng)基上，使其均勻攤布；迅速對(duì)稱放置無(wú)菌牛津杯（外徑7.8 mm），待上層帶菌培養(yǎng)基冷卻后，向牛津杯中加入水提液（100 μL/孔）；使用無(wú)菌水作對(duì)照，37℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

2.2.4 霉菌抑制試驗(yàn)

將無(wú)菌水提物均勻混入PDA培養(yǎng)基，使其濃度為1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL，并傾倒在平板上；待其凝固后，在平板中心接種直徑為0.5 cm的青霉菌塊；30℃培養(yǎng)5 d，測(cè)量菌落直徑。

2.2.5 天然復(fù)合防腐劑最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

參照張亞楠[10]的研究，并稍作改動(dòng)。選取榆耳、桑黃水提液最佳抑菌濃度，配制天然復(fù)合防腐劑。用無(wú)菌水將復(fù)合防腐劑梯度稀釋，使復(fù)合防腐劑的體積分別占總體積的0%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、80%、100%。在對(duì)應(yīng)的平板培養(yǎng)基中，分別加入不同濃度的復(fù)合防腐劑100 μL，再加入濃度為106cfu/mL的菌液或孢子懸浮液100 μL，涂布均勻；稍干后，置于適宜溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)（細(xì)菌30℃培養(yǎng)24 h；霉菌30℃培養(yǎng)3 d）。通過(guò)測(cè)定其對(duì)不同腐敗菌的抑制效果，確定天然復(fù)合防腐劑的最小抑菌濃度（MIC）。

3 結(jié)果與分析

3.1 對(duì)細(xì)菌的抑制效果

抑菌圈的直徑大小能夠表示水提液的抑菌能力，其直徑越大，表明其抑菌能力越強(qiáng)。從表1可以看出，榆耳和桑黃水提液的抑菌能力均隨水提液濃度的升高而增強(qiáng)，整體對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌的抑菌能力稍強(qiáng)于陰性菌大腸桿菌；在相同的水提液濃度下，桑黃對(duì)細(xì)菌的抑制能力略強(qiáng)于榆耳，在水提液濃度為1 mg/mL時(shí)，桑黃即對(duì)2種細(xì)菌表現(xiàn)出抑制能力；當(dāng)水提液濃度為20～50 mg/mL時(shí)，2種水提液均有較好的抑菌效果?？紤]到成本因素，可選擇2種水提液濃度為均為20 mg/mL。

表1 榆耳、桑黃2種水提液對(duì)細(xì)菌的抑制效果

3.2 對(duì)霉菌的抑制效果

從表2可以看出，在桑黃水提物的作用下，青霉的生長(zhǎng)速度隨作用濃度的升高而不斷降低，而榆耳水提物對(duì)青霉的抑制效果不明顯。在10 mg/mL、50 mg/mL時(shí)，桑黃水提物對(duì)青霉的抑制效果分別達(dá)到45%和76%。

表2 榆耳、桑黃2種水提液霉菌的抑制效果

3.3 榆耳、桑黃天然復(fù)合防腐劑的MIC

按照榆耳水提物20 mg/mL、桑黃水提物20 mg/mL配制天然復(fù)合防腐劑。通過(guò)測(cè)定對(duì)不同腐敗菌的抑制效果，確定天然復(fù)合防腐劑的MIC。結(jié)果表明，復(fù)合防腐劑對(duì)細(xì)菌、青霉均有明顯的抑制效果，能夠顯著擴(kuò)大抑菌譜，且對(duì)細(xì)菌的抑制作用明顯優(yōu)于霉菌，見(jiàn)表3。

食用菌腐敗初期一般都是以細(xì)菌侵害為主，因此，本文以完全不長(zhǎng)細(xì)菌的濃度作為該天然復(fù)合防腐劑的最小抑菌濃度。從表3可知，當(dāng)復(fù)合防腐劑的濃度在20%時(shí)，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均不生長(zhǎng)，大腸桿菌零星生長(zhǎng)；當(dāng)濃度達(dá)到25%時(shí)，3種細(xì)菌均不生長(zhǎng)，因此榆耳、桑黃天然復(fù)合防腐劑的MIC為25%，此時(shí)，其對(duì)細(xì)菌完全抑制，霉菌受明顯抑制，表明其抑菌活性良好。

表3 榆耳、桑黃天然復(fù)合防腐劑的MIC

4 結(jié)論

榆耳、桑黃天然復(fù)合防腐劑最佳配比為：榆耳水提物20mg/mL、桑黃水提物20mg/mL；以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3種細(xì)菌為指示菌，測(cè)得復(fù)合防腐劑最小抑菌濃度為25%。本文研究的榆耳、桑黃天然復(fù)合防腐劑，對(duì)細(xì)菌、霉菌均有明顯的抑制效果，且對(duì)細(xì)菌的抑制作用明顯優(yōu)于霉菌，具有抑菌譜較廣的優(yōu)點(diǎn)，可在實(shí)際工作中應(yīng)用。