超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定毛發(fā)中5種芬太尼類新精神活性物質(zhì)的方法研究與應(yīng)用

薛康 何嘉玲 吳雪梅 周鑫平 肖宇 胡江濤 何開(kāi)蓉*

（1.成都海關(guān)技術(shù)中心 四川成都 610041；2.食品安全檢測(cè)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.四川百茶百道實(shí)業(yè)股份有限公司）

1 前言

芬太尼是20世紀(jì)50年代由比利時(shí)科學(xué)家保羅·楊森作為鎮(zhèn)痛藥開(kāi)發(fā)的，是一種強(qiáng)效的阿片受體激動(dòng)劑[1]。后來(lái)通過(guò)對(duì)芬太尼的結(jié)構(gòu)進(jìn)行不斷修飾，已出現(xiàn)了數(shù)十種芬太尼類衍生物，近年來(lái)，芬太尼類新精神活性物質(zhì)的濫用已經(jīng)引起國(guó)際社會(huì)的高度關(guān)注。2018年12月，中美元首會(huì)晤后，兩國(guó)在禁毒方面達(dá)成新的合作意向與共識(shí)，我國(guó)決定對(duì)芬太尼類物質(zhì)進(jìn)行整類列管，將其指定為受控的新精神活性物質(zhì)，并列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》。

檢材是案件的重要證據(jù)，如血液、毛發(fā)、尿液、分泌液和胃容物等，是法醫(yī)毒物實(shí)驗(yàn)室常用的生物檢材。生物檢材的處理關(guān)系到分析結(jié)果的科學(xué)性與準(zhǔn)確度，會(huì)對(duì)案件的偵辦產(chǎn)生直接影響。血樣、尿樣及唾液在采樣及保存過(guò)程中易受污染而造成假陰性，且其檢出時(shí)間較短。因此，有時(shí)需要用易采集、易保存及檢測(cè)窗口較長(zhǎng)的毛發(fā)來(lái)進(jìn)行鑒定。毛發(fā)具有可長(zhǎng)時(shí)間保留藥史等優(yōu)點(diǎn)，可作為體液檢材的有效補(bǔ)充，有時(shí)，其甚至?xí)蔀樘峁┓ㄍプC據(jù)的唯一手段[2]。因此，本文選擇毛發(fā)樣品作為本次試驗(yàn)的檢材。

目前對(duì)芬太尼類物質(zhì)及其代謝物的檢驗(yàn)方法主要有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[3-5]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[6-8]、液相色譜法[9]等。本文擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)毛發(fā)中5種芬太尼類物質(zhì)進(jìn)行精確定性與定量檢測(cè)，旨在建立一種靈敏度和準(zhǔn)確度高、特異性和可操作性強(qiáng)的芬太尼類物質(zhì)檢驗(yàn)方法，為實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑、材料

ACQUITY UPLC I-Class TQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；3H20RI離心機(jī)（中國(guó)赫西）；AE240電子天平（瑞士梅特勒）；XW-80A旋渦混合器（中國(guó)HUXI）；B8510E-DTH超聲波清洗器（美國(guó)必能信）；Mili-Q Integral 3超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

芬太尼（Fentanyl，CAS 437-38-7）；羥化去甲芬太 尼（Hydroxynorfentanyl，CAS 83708-10-5）；乙 酰芬太尼（Acetylfentanyl，CAS 3258-84-2）；去甲舒芬太尼（Norsufentanil；CAS 61086-18-8）；2，3-司可芬太尼（2，3-seco-Fentanyl；CAS 253342-66-4）。其中，乙酰芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為50 μg/mL，其他4種芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為100 μg/mL。甲醇（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司）；乙腈（HPLC級(jí)，F(xiàn)isher公司）乙酸銨（HPLC純，ACS公 司）；甲 酸（HPLC級(jí)，CNW公司），其他試劑均為分析純。

2.2 溶液配制

取各芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品適量，用溶劑配制成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品中間溶液；用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成濃度為50.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

2.3 樣品處理

毛發(fā)樣品依次用適量水和丙酮振蕩洗滌2次；晾干后剪成約1 mm段；置于2 mL研磨管中，用毛發(fā)研磨器粉碎成粉末狀。

稱取毛發(fā)粉末20 mg，加入1.0 mL甲醇溶液，浸泡4 h；冰浴超聲30 min；加入1.0 mL初始流動(dòng)相，6 000 r/min離心5 min；取1.0 mL上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，供儀器分析。

2.4 儀器條件

2.4.1 質(zhì)譜條件

離子化源模式：ESI+；霧化溫度：550℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM）；毛細(xì)管電壓：2.83 kV；脫溶劑氣流量：1 000 L/hr；霧化氣40 psi。各化合物參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 5種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

2.4.2 色譜條件

HSS T3色譜柱（100mm×2.1mm，1.8 μm，美國(guó)Waters公司），柱溫35℃；流動(dòng)相A：5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸緩沖溶液，流動(dòng)相B：乙腈；流速為0.30 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL。采用梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的選擇

芬太尼類化合物的分子結(jié)構(gòu)主要由丙基烷基酰胺、哌啶基環(huán)和苯基烷基部分組成，具有一定的極性，故本文采用HSS T3色譜柱。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)比對(duì)乙腈—5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）、乙腈—水（0.1%甲酸）、甲醇—5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）、甲醇—水（0.1%甲酸）4組流動(dòng)相對(duì)目標(biāo)物的選擇與分離效果。結(jié)果表明，將乙腈—5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，5種目標(biāo)物均能夠得到較好的分離度和峰形，譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 5種芬太尼類物質(zhì)總離子流圖

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用正離子模式（ESI+）和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式（MRM）優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。將100 ng/mL的芬太尼類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析，調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓，使一級(jí)質(zhì)譜中基峰離子響應(yīng)最強(qiáng)，二級(jí)質(zhì)譜的母離子選擇一級(jí)質(zhì)譜中的基峰離子，確定各化合物的母離子后，通過(guò)調(diào)節(jié)優(yōu)化CE電壓和DP電壓，進(jìn)行篩選最優(yōu)子離子，保證子離子的靈敏度，5種芬太尼類物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.3.1 線性范圍

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品中間液適量，用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50 ng/mL的工作濃度。以每個(gè)目標(biāo)物響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（y），目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），最小二乘法進(jìn)行回歸（權(quán)重系數(shù)為1/x），求得線性方程和線性系數(shù)。結(jié)果表明在質(zhì)量濃度為0.5～50.0 ng/mL范圍內(nèi)，5種芬太尼類化合物具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99。

3.3.2 檢出限和定量限

將配置的校準(zhǔn)曲線樣品按照1.3方法進(jìn)行處理并檢測(cè)，以3倍信噪比（S/N≥3）和10倍信噪比（S/N≥10）計(jì)算檢出限和定量限，5種芬太尼類物質(zhì)的檢出限均為0.01 ng/mg，定量限為0.03 ng/mg。

3.3.3 準(zhǔn)確度、精密度和回收率

稱取數(shù)份20 mg空白毛發(fā)樣本，分別滴加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，晾干，配置成低（0.05 ng/mg）、中（0.2 ng/mg）和高（1.0 ng/mg）3個(gè)濃度的樣本溶液，經(jīng)1.3方法處理后檢測(cè)，記錄每種芬太尼類物質(zhì)在3個(gè)濃度的平均峰面積As，同時(shí)用甲醇稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配置成濃度為0.1 ng/mL、4.0 ng/mL和20.0 ng/mL的對(duì)照品，上機(jī)檢測(cè)得到每種芬太尼類物質(zhì)在這3個(gè)濃度的峰面積Am，以As/Am計(jì)算準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表3。

將低（0.05 ng/mg）、中（0.2 ng/mg）和高（1.0 ng/mg）3個(gè)濃度的樣本每個(gè)配制6份，處理后分析，計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)檢測(cè)3 d，計(jì)算日間精密度；同時(shí)計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各芬太尼類物質(zhì)的準(zhǔn)確度、回收率及精密度

3.4 方法應(yīng)用

該試驗(yàn)采用樣品添加的方式模擬實(shí)際案例。取適量毛發(fā)，浸泡在1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中72 h，取出后晾干，按照2.3方法處理并做加標(biāo)回收，提取液上機(jī)檢測(cè)，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法如上文所述，5種芬太尼類新精神活性物質(zhì)在此份毛發(fā)樣品中均被檢出且加標(biāo)回收率在90.5%～108.5%之間。

4 結(jié)論

本文采用了UPLC-MS/MS技術(shù)建立毛發(fā)中5種芬太尼類新精神活性物質(zhì)的檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單，成本低、靈敏度高，可應(yīng)用于臨床試驗(yàn)毛發(fā)檢材中芬太尼類新精神活性物質(zhì)的檢測(cè)，滿足檢驗(yàn)鑒定的要求。芬太尼類物質(zhì)作為一種新精神活性物質(zhì)，已被整類列管，由于其藥性極強(qiáng)，成癮性很高，因此需要相關(guān)部門的重視，加強(qiáng)技術(shù)投入，嚴(yán)格監(jiān)控芬太尼類物質(zhì)的濫用情況。