節(jié)律基因NPAS2在腫瘤中的研究進(jìn)展

陳雅凡 王剛 田藝苑 同紅偉，4 袁鵬

作者單位：710068 西安 1西安體育學(xué)院研究生部；710068 西安 2西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)與健康科學(xué)學(xué)院；716000 延安 3延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院；716099 延安 4延安市人民醫(yī)院；710038 西安 5空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科

生物節(jié)律是生物體在適應(yīng)地球自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn)所表現(xiàn)出與環(huán)境相適應(yīng)的一系列的周期性變化，是生物體在漫長的生物進(jìn)化過程中形成的一種內(nèi)源性節(jié)律。在哺乳動(dòng)物中，生物節(jié)律主要是由一系列核心生物鐘基因轉(zhuǎn)錄和翻譯后形成負(fù)反饋環(huán)路調(diào)控，進(jìn)而產(chǎn)生諸如激素分泌、體溫波動(dòng)等晝夜節(jié)律。哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)包括位于大腦的中央振蕩器，以及除大腦外身體幾乎所有的組織器官中的外周振蕩器。中央振蕩器又叫中樞時(shí)鐘，位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的神經(jīng)元，SCN接收來自視網(wǎng)膜的光信息，中樞時(shí)鐘通過神經(jīng)和體液途徑使外周時(shí)鐘與外部光/暗周期同步［1］。目前，已有9種在哺乳動(dòng)物下丘腦視交叉上核和外周組織中表達(dá)的核心晝夜節(jié)律基因被廣泛研究，包括神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白2（neuronal PAS domain protein 2，NPAS2）、腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1（brain and muscle ARNT-like protein 1，BMAL1）、晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障（circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK）、CRY1/2、PER1/2/3、CSNK1E、NR1D1/2、RORA和TIMELESS［2］，其中NPAS2是哺乳動(dòng)物分子量最大的核心節(jié)律基因，參與生物鐘的調(diào)控。NPAS2還可以通過調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因，參與腫瘤發(fā)生、腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移等多個(gè)細(xì)胞活動(dòng)過程。本文就NPAS2在腫瘤中作用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 NPAS2概述

1.1 NPAS2的結(jié)構(gòu)

NPAS2最早于1996年由ZHOU等在研究小鼠大腦早期發(fā)育時(shí)被發(fā)現(xiàn)，是目前檢測到的最大核心生物鐘基因（176.68 kb），定位于人染色體2p11.2-2q13上［3］，含有37個(gè)外顯子，轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生23個(gè)不同的mRNAs，16個(gè)可變剪切異構(gòu)體，12個(gè)可變啟動(dòng)子。NPAS2蛋白屬于bHLH-PAS轉(zhuǎn)錄因子家族。N端包括9～59位氨基酸組成的堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）結(jié)構(gòu)域、82～152位氨基酸組成的PAS-A結(jié)構(gòu)域、237～307位氨基酸組成的PAS-B結(jié)構(gòu)域以及311～354位氨基酸組成的PAC結(jié)構(gòu)域。bHLH結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，促進(jìn)二聚體的形成，PAS-A和PAS-B結(jié)構(gòu)域大約有260個(gè)氨基酸的長度，含有2個(gè)約含60個(gè)氨基酸的同向重復(fù)，可介導(dǎo)與DNA結(jié)合，PAC結(jié)構(gòu)域伴隨PAS結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)，有助于PAS結(jié)構(gòu)域的折疊。NPAS2的C端則是核受體連接區(qū)，可調(diào)節(jié)與NPAS2有關(guān)的核受體結(jié)合［4］，見圖1。

圖1 NPAS2蛋白的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of NPAS2 protein

1.2 NPAS2的表達(dá)與調(diào)節(jié)

NPAS2在人體分布廣泛，不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，還在除睪丸組織外的幾乎所有外周組織中分布，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布于SCN［5］。NPAS2與另一核心節(jié)律基因CLOCK為同源基因，都具有bHLH/PAS結(jié)構(gòu)域和核受體相互作用域［6］。有研究報(bào)道在外周組織和視交叉神經(jīng)核中NPAS2功能上可以替代CLOCK調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律［7］，兩者都能與BMAL1結(jié)合形成異源二聚體。NPAS2因可結(jié)合亞鐵血紅素而對CO敏感，而CO主要通過與PAS-A結(jié)合域結(jié)合，阻礙bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合［8］。NPAS2本身對E-box序列沒有親和力，不能單獨(dú)與DNA結(jié)合，只有與BMAL1形成的異源二聚體才能與DNA的E-box結(jié)合［9］。因此，CO濃度高時(shí)會(huì)影響NPAS2/BMAL1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，當(dāng)CO濃度較低時(shí)，其轉(zhuǎn)錄功能恢復(fù)。

隨著地球自轉(zhuǎn)，哺乳動(dòng)物的生物節(jié)律會(huì)通過節(jié)律基因轉(zhuǎn)錄、翻譯而形成的負(fù)反饋環(huán)路不斷進(jìn)行周期性調(diào)節(jié)和振蕩［10］，其中負(fù)反饋環(huán)路包括正向環(huán)路和反向環(huán)路。核心的節(jié)律基因包括BMAL1、CLOCK、CRY1/2、PER1/2/3、NPAS2、CSNK1E、NR1D1/2、RORA和TIMELESS，其中正向環(huán)路又包括NPAS2、CLOCK和BMAL1。NPAS2（或CLOCK）與BMAL1結(jié)合形成異源二聚體，并在下游節(jié)律因子如周期蛋白（period，PER）家族和隱花色素（cryptochrome，CRY）家族啟動(dòng)子的E-box上激活其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)CRY和PER蛋白在細(xì)胞質(zhì)積累［11］。當(dāng)CRY和PER積累到一定程度，PER會(huì)被酪氨酸激酶磷酸化，與CRY形成異源二聚體后入核，隨著PER與CRY入核增多，PER/CRY異源二聚體會(huì)抑制NPAS2/BMAL1或CLOCK/BMAL1復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄激活作用，進(jìn)而形成負(fù)向環(huán)路［12］。但隨著PER/CRY復(fù)合物的降解，其對NPAS2/BMAL1或CLOCK/BMAL1復(fù)合體的抑制作用逐漸減弱，復(fù)合體將恢復(fù)與靶基因E-box結(jié)合，再次激發(fā)轉(zhuǎn)錄，正反環(huán)路循環(huán)往復(fù)，從而形成晝夜節(jié)律的負(fù)反饋環(huán)路［13］，見圖2。

圖2 晝夜節(jié)律反饋環(huán)路Fig.2 Circadian rhythm feedback loops

2 NPAS2在腫瘤中的作用

NPAS2主要作為生物鐘基因參與正常晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，當(dāng)NPAS2出現(xiàn)異常，可能會(huì)出現(xiàn)與節(jié)律相關(guān)的疾病，如癌癥、心血管疾病和代謝綜合征等［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)生物鐘基因突變后，轉(zhuǎn)基因小鼠更易發(fā)展成惡性腫瘤和導(dǎo)致幼稚細(xì)胞老化［16］。生物的晝夜節(jié)律失調(diào)是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的內(nèi)在因素之一，尤其是在激素依賴性腫瘤如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌等腫瘤中發(fā)揮重要作用［17］，由此可見晝夜節(jié)律的改變可影響腫瘤的易感性。目前研究顯示，NPAS2主要通過調(diào)控細(xì)胞周期、增殖和代謝參與腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移等多個(gè)細(xì)胞活動(dòng)過程，并在各類型腫瘤中得到驗(yàn)證［18-19］。

2.1 乳腺癌

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，約占癌癥患者總數(shù)的36%［20］。根據(jù)其臨床特征和病理特性，常分為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性、人表皮生長因子受體2（human epithelial growth factor receptor，HER2）陽性和三陰性乳腺癌［21］。乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤，褪黑素和雌激素在乳腺癌發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在ER陽性的乳腺癌患者中，褪黑素的抑癌作用主要是通過抑制褪黑素受體1的ER mRNA表達(dá)和ER轉(zhuǎn)錄活性來實(shí)現(xiàn)，褪黑素不僅可以調(diào)節(jié)核受體的反式激活和雌激素代謝酶及相關(guān)基因的表達(dá)，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解和與細(xì)胞增殖、生存、轉(zhuǎn)移有關(guān)的關(guān)鍵細(xì)胞信號通路［22］。褪黑素通常在夜間分泌，有明顯的晝夜節(jié)律性，晝夜顛倒會(huì)導(dǎo)致褪黑素信號被破壞，從而促進(jìn)人類乳腺癌的生長［23］。而隨著現(xiàn)代生活方式的改變，白晝環(huán)境中的非自然光和夜間人工照明的周期越來越長，破壞了晝夜節(jié)律的內(nèi)源性穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤發(fā)展并加速其進(jìn)展［24］。乳腺癌流行病學(xué)研究顯示，倒班工作會(huì)增加患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［25］。NPAS2蛋白大部分位于細(xì)胞漿內(nèi)，也有部分位于細(xì)胞核，在正常乳腺組織、乳腺癌前病變和浸潤癌中均有表達(dá)。與正常組織相比，NPAS2蛋白在原位癌和浸潤癌中表達(dá)下調(diào)。在不同分期浸潤癌中，與Ⅰ期比較，Ⅱ期、Ⅲ期乳腺癌中NPAS2表達(dá)明顯減弱，提示NPAS2的功能減弱是乳腺癌發(fā)生的重要因素，且與乳腺癌分期有關(guān)［23］。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NPAS2會(huì)使大量的乳腺癌細(xì)胞停滯在G0/G1期而不能向S期轉(zhuǎn)化，這可能是NPAS2抑制了ERα的轉(zhuǎn)錄活性，隨之下調(diào)了細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，最終抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖［26］。綜上所述，乳腺癌發(fā)生與生物鐘基因表達(dá)異常、突變和多態(tài)性有關(guān)，且在乳腺癌中NPAS2可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，未來進(jìn)一步探索節(jié)律基因和乳腺癌的關(guān)系，可能對乳腺癌的治療策略和路徑具有借鑒意義。

2.2 前列腺癌

前列腺癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在男性惡性腫瘤中居第二位，死亡率居第五位［27］。前列腺癌具有高度異質(zhì)性，不僅表現(xiàn)在不同患者之間腫瘤組織學(xué)的特征差異，還表現(xiàn)在同一患者不同腫瘤細(xì)胞在生長、侵襲、轉(zhuǎn)移速度上的差異［28］。目前已有研究表明，節(jié)律基因與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。一項(xiàng)病例對照試驗(yàn)探索了9種晝夜節(jié)律基因與前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)之間的聯(lián)系，結(jié)果顯示前列腺癌與NPAS2和PER1表達(dá)有關(guān)［29］。另有文獻(xiàn)報(bào)道PER1在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)可抑制細(xì)胞生長和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［30］、PER3在腫瘤微環(huán)境中可通過WNT/β-catenin信號通路負(fù)向調(diào)節(jié)前列腺癌干細(xì)胞［31］。此外，與在完全黑暗的環(huán)境中睡覺相比，在強(qiáng)度較高的光照環(huán)境中睡覺會(huì)增加罹患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［32］，但褪黑素能使前列腺癌細(xì)胞中失調(diào)的晝夜節(jié)律重新同步化［33］。一項(xiàng)納入1 511名男性工人的基因分型數(shù)據(jù)研究，評估了前列腺癌和晝夜節(jié)律基因變異和夜間工作指標(biāo)之間的相互作用，結(jié)果顯示晝夜節(jié)律通路與夜間工作者中侵襲性前列腺癌的發(fā)生顯著相關(guān)，尤其是長時(shí)間夜班的男性，且其侵襲性前列腺癌與NPAS2和BMAL1均有關(guān)聯(lián)［34］。YU等［35］發(fā)現(xiàn)NPAS2 rs6542993與局部和晚期前列腺癌病例的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)明顯升高有關(guān)。綜上所述，目前有關(guān)NPAS2與前列腺癌關(guān)系的研究主要聚焦于患病風(fēng)險(xiǎn)，關(guān)于NPAS2與前列腺癌細(xì)胞之間內(nèi)在聯(lián)系與具體作用機(jī)制的研究仍需進(jìn)一步探索。

2.3 肝癌

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，占原發(fā)性肝癌病例的75%～85%［36］。目前常用的肝癌診斷標(biāo)志物的敏感度和特異性仍不理想，尤其是用于早期肝癌診斷的分子標(biāo)志物［19］。既往研究顯示，晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)異常與HCC發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［37］。YUAN等在證實(shí)了NPAS2基因的功能多態(tài)性與經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞治療的HCC患者的總生存期相關(guān)后［38］，還在217例肝癌組織中發(fā)現(xiàn)NPAS2表達(dá)明顯高于癌旁組織，且表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)［39］；NPAS2還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制線粒體依賴性內(nèi)在凋亡促進(jìn)肝癌細(xì)胞存活。該研究還進(jìn)一步探究了NPAS2在HCC葡萄糖代謝過程的作用，結(jié)果顯示NPAS2在低氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)下上調(diào)了糖酵解基因，下調(diào)了過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α的表達(dá)，從而在HCC生長和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［40］。此外，肝臟疾病發(fā)展到肝癌會(huì)經(jīng)歷肝纖維化的過程，有研究證明，肝纖維化損傷后，NPAS2在肝星狀細(xì)胞中上調(diào)，隨后直接轉(zhuǎn)錄激活發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1，從而促進(jìn)纖維化［41］。上述研究不僅表明了NPAS2在HCC中扮演著“促癌”的角色，同時(shí)也展現(xiàn)了NPAS2成為HCC標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。然而，HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，NPAS2是否與其他類型肝癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，例如是否參與非酒精性脂肪性肝炎以及非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝癌的發(fā)生，及其可能的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

2.4 非霍奇金淋巴瘤

晝夜節(jié)律基因有可能影響多種癌癥相關(guān)的生物學(xué)途徑，晝夜節(jié)律紊亂導(dǎo)致的免疫失調(diào)，是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）的風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)也可能影響NHL的易感性［42］。ZHU等［43］報(bào)道NPAS2多態(tài)性與NHL發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低有密切聯(lián)系，研究不僅表明了晝夜節(jié)律生物標(biāo)志物可能與NHL預(yù)后相關(guān)，還檢測到晝夜節(jié)律基因NPAS2與NHL可能存在因果關(guān)系，該結(jié)果提供了首個(gè)分子流行病學(xué)上晝夜節(jié)律基因?qū)α馨土霭l(fā)生作用的證據(jù)支持。綜上提示NPAS2可能成為一個(gè)新穎的NHL生物標(biāo)志物，但鑒于NHL的發(fā)病率不斷增加，其病因并不十分明確，NPAS2與NHL的患病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后，有待進(jìn)一步研究。

2.5 子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌根據(jù)組織學(xué)可分為子宮內(nèi)膜型和非子宮內(nèi)膜異型，其中子宮內(nèi)膜型是雌激素依賴型，約占子宮內(nèi)膜病例的80%，通常預(yù)后較好，而非子宮內(nèi)膜異型（如漿液型和透明細(xì)胞型）由于對雌激素反應(yīng)不強(qiáng)，往往預(yù)后不良［44］。ZHENG等［45］研究發(fā)現(xiàn)，在子宮體子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）組織中NPAS2表達(dá)上調(diào)，且NPAS2高表達(dá)會(huì)降低UCEC患者的總體生存率、無病生存率和無復(fù)發(fā)生存率；NPAS2表達(dá)還與UCEC的臨床分期、腫瘤分級、ER狀態(tài)和子宮肌層浸潤水平呈顯著正相關(guān)；NPAS2在UCEC中不僅可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成，還可以通過增強(qiáng)腫瘤免疫細(xì)胞浸潤發(fā)揮致癌作用。因此認(rèn)為，NPAS2可能是UCEC中的癌基因，有望成為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后標(biāo)志物。

2.6 急性髓系白血病

白血病是循環(huán)系統(tǒng)的惡性腫瘤，特征為造血細(xì)胞或最終分化的白細(xì)胞不受控制的過度生長，其中急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）是成年人中最常見的急性白血病，其侵襲性和異質(zhì)性強(qiáng)，患者總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率極低［46］，因此尋找AML新的分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)尤為重要。牟佼等［47］通過對46例AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的NPAS2水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NPAS2在AML患者中表達(dá)上調(diào)且與不良預(yù)后相關(guān)，而干擾AML細(xì)胞系中的NPAS2表達(dá)可抑制細(xì)胞生長。SONG等［48］研究顯示，NPAS2在AML細(xì)胞中高表達(dá)，敲低NPAS2可明顯抑制AML細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)NPAS2可能通過CDC25A調(diào)控Caspase-3和bcl2/bax的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期改變。以上研究表明，NPAS2可能是AML細(xì)胞惡性生長的關(guān)鍵調(diào)控因子，但在其他類型白血病中是否發(fā)揮同樣作用還需進(jìn)一步探究。

2.7 其他腫瘤

除了上述癌種，NPAS2還與其他癌種有關(guān)。MADDEN等［49］使用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)集分析與神經(jīng)膠質(zhì)瘤風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后相關(guān)的核心生物鐘基因，發(fā)現(xiàn)NPAS2的表達(dá)升高與患者的不良預(yù)后有關(guān)。YANG等［50］發(fā)現(xiàn)NPAS2在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，且NPAS2高表達(dá)患者的5年生存率明顯高于NPAS2低表達(dá)患者，表明NPAS2在結(jié)直腸癌患者預(yù)后中具有預(yù)測價(jià)值。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLD-1中，NPAS2具有抑制細(xì)胞增殖、侵襲和細(xì)胞劃痕愈合能力［51］。另有研究發(fā)現(xiàn)，NPAS2 rs895520的次要等位基因與33%肉瘤和44%平滑肌肉瘤易感性增加相關(guān)［52］。此外，在腎癌患者中，NPAS2低表達(dá)的患者預(yù)后良好［53］。而在未分化甲狀腺癌中，NPAS2明顯上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展［54］。綜上所述，NPAS2在各類型腫瘤中發(fā)揮作用不同，但是在單一癌種中的研究不夠全面，仍需進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

核心節(jié)律基因NPAS2雖然早已被發(fā)現(xiàn)，但是其功能尤其是在癌癥發(fā)生和進(jìn)展中的功能研究還有限。目前研究顯示，晝夜節(jié)律的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，核心節(jié)律基因NPAS2具有明顯的組織特異性，在人體不同類型腫瘤組織中表達(dá)異常，但在不同類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中可能發(fā)揮的作用不同，可能作為抑癌基因也可能作為促癌基因發(fā)揮作用，因此具有成為腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。但由于NPAS2參與了機(jī)體大量的生理過程，對其作用和功能的全面理解有待于進(jìn)一步的研究。深入探索NPAS2與腫瘤之間的聯(lián)系和內(nèi)在機(jī)制，將為揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤的預(yù)防和治療提供新思路，同時(shí)也有助于驗(yàn)證其作為新的治療靶點(diǎn)和標(biāo)志物的可能性。