殼聚糖復(fù)合納米載藥體系的構(gòu)建及其釋藥性能

趙 婧，崔 潞，李映璐，王曉冉，張 勇

(西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048)

0 引 言

癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，也是最具挑戰(zhàn)性的醫(yī)學(xué)問(wèn)題之一[1]?；熓悄壳白钪饕陌┌Y治療方式[2]。5-氟尿嘧啶(5-FU)作為常用的化療藥物，在體內(nèi)先轉(zhuǎn)化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，與還原型四氫葉酸及胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)結(jié)合，干擾腫瘤細(xì)胞的核酸代謝，從而達(dá)到抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的目的[3]；丹參素鈉(SAS)是從丹參根中提取的一類抗癌藥物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多效作用，已證實(shí)其具有抑制癌癥惡性細(xì)胞的行為[4]。傳統(tǒng)的化療藥物對(duì)正常細(xì)胞及組織毒副作用大、易分解，對(duì)癌細(xì)胞無(wú)特異性和排泄，半衰期短、生物利用率低、水溶性較差，靜脈注射后可能導(dǎo)致栓塞和局部毒性，且面臨多重耐藥性等挑戰(zhàn)[5-7]。因此，迫切需要尋找理想的藥物輸送體系，以克服上述存在的問(wèn)題。納米技術(shù)對(duì)生物醫(yī)學(xué)和疾病診斷/治療產(chǎn)生了極其重要的影響[8-10]。納米藥物載體憑借其小尺寸效應(yīng)和獨(dú)特的表面性質(zhì)，增溶疏水藥物的同時(shí)保護(hù)藥物免受過(guò)早降解；消除體內(nèi)生物屏障對(duì)藥物的阻隔，提高其生物利用度；延長(zhǎng)藥物的停留時(shí)間，從而減少所需劑量，延長(zhǎng)給藥間隔[11-12]。此外，還可以通過(guò)增強(qiáng)滲透和滯留(EPR)效應(yīng)，被動(dòng)靶向至腫瘤組織，從而提高現(xiàn)有化療藥物在治療癌癥過(guò)程中的安全性和有效性[13-15]。

殼聚糖(CS)作為一種天然陽(yáng)離子多糖，被認(rèn)為是一種具有廣泛醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景的生物材料。由于其獨(dú)特的生物相容性、抗菌抑菌、抗膽固醇、抗癌和黏膜黏附特性[16-18]，不會(huì)引發(fā)人體的免疫排斥反應(yīng)；同時(shí)，CS還具有生物降解性，可被溶菌酶和殼聚糖酶等內(nèi)部酶降解，以獲得低聚糖和單糖，隨后被身體吸收；CS表面富有大量的反應(yīng)活性位點(diǎn)，負(fù)載藥物可以通過(guò)化學(xué)交聯(lián)、靜電吸附等多種作用方式，在藥物表面形成一層“半透膜”，使得藥物釋放過(guò)程需要克服大分子骨架的阻礙，達(dá)到緩釋控釋的目的。CS是一種極具潛力的藥物載體材料[19]，不僅能夠負(fù)載多種藥物，包括大分子蛋白質(zhì)/多肽、小分子親水/親脂抗癌藥物以及DNA、miRNA、siRNA等[20-23]，還可通過(guò)鼻腔、靜脈、口腔和眼部等多種給藥途徑達(dá)到治療目的[24-26]。

本文以陽(yáng)離子多糖殼聚糖作為聚陽(yáng)離子，N-異丙基丙烯酰胺和2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸的共聚物為聚陰離子，通過(guò)聚電解質(zhì)復(fù)合法[27-30]制備殼聚糖納米載藥體系。在制備過(guò)程中分別負(fù)載5-氟尿嘧啶與丹參素鈉2種模型藥物，無(wú)需使用有機(jī)溶劑、化學(xué)交聯(lián)劑或表面活性劑，具有毒性更小、安全性更高的優(yōu)勢(shì)，并實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間緩釋控釋，提高抗癌藥物的治療效果。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

殼聚糖(CS，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，分析純)；N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm，上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，分析純)；2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS，阿拉丁試劑有限公司，分析純)；偶氮二異庚腈(AVBN，阿拉丁試劑有限公司，分析純)；5-氟尿嘧啶(5-FU，西安優(yōu)博生物試劑有限公司，分析純)；丹參素鈉(C9H9NaO5，SAS，阿拉丁試劑有限公司，分析純)。

1.1.2 儀器

傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet5700，美國(guó)ThermoNicolet公司)；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(Quanta-450，美國(guó)FEI公司)；冷凍干燥機(jī)(FD-1，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；恒溫振蕩器(SHA-C，常州市中貝儀器有限公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津公司)；激光粒度儀(90Plus Zeta，布魯克海文)。

1.2 材料的制備及表征

1.2.1 載藥納米顆粒條件優(yōu)化

以N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸(AMPS)為單體，以偶氮二異庚腈為引發(fā)劑，采用自由基溶液聚合法合成陰離子聚合物NIPAm-co-AMPS, 即PNAM。采用混合法制備載藥納米顆粒，具體步驟如下：分別配制 CS醋酸溶液與PNAM水溶液，質(zhì)量濃度為0.8 g/L，用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.0左右；分別準(zhǔn)確稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%的5-FU/SAS溶于CS醋酸溶液中，磁力攪拌2 h；然后將溶入藥物的CS溶液以2 μL/s的速度緩慢滴入聚合物PNAM溶液中，體積比控制為5∶3; 滴加完畢后室溫繼續(xù)攪8 h，得到載藥納米顆粒分散液；將分散液用G1砂芯漏斗過(guò)濾除去大的聚集體，上清液用超濾離心管離心數(shù)次，直到濾液中無(wú)藥物的紫外吸收；經(jīng)水性濾膜過(guò)濾后，冷凍干燥得到納米顆粒。殼聚糖納米載藥體系制備示意圖如圖1所示。

圖 1 殼聚糖納米載藥體系的制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of chitosan nano drug delivery system

1.2.2 載藥納米顆粒的表征

1) 紅外表征。取適量納米顆粒粉末用KBr壓片后，采用紅外光譜儀在500～4 000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)定其紅外光譜。

2) 粒徑大小及分布。分別調(diào)節(jié)5-FU/SAS不同藥物投加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30%、40%、50%)、5-FU/SAS不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)，溶入5-FU或SAS的CS溶液與PNAM體積比(10∶1、10∶3、10∶5、10∶7、10∶9)，制備殼聚糖載藥納米顆粒，用DLS測(cè)定其粒徑尺寸及分布系數(shù)(PdI)。PdI值越小，說(shuō)明粒徑分布越均勻。

3) 尺寸及形貌表征。將載丹參素鈉/5-氟尿嘧啶殼聚糖納米顆粒分別分散在去離子水中，滴到銅網(wǎng)上，待干燥后，利用透射電鏡(TEM)表征其尺寸及形貌。

1.3 載藥量及包封率的測(cè)定

將冷凍干燥后的納米顆粒溶解于1 mol/L HCl中，用紫外分光光度法測(cè)定納米顆粒包裹5-FU和丹參素鈉的量。通過(guò)測(cè)定樣品最大吸收波長(zhǎng)處(5-FU 266 nm、丹參素鈉281 nm)的紫外吸收值并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算載藥量(LC)和包封率(EE)。

式中：md為包裹于納米顆粒中藥物的質(zhì)量；mn為載藥納米顆粒的質(zhì)量；mt為藥物加入總量。

1.4 體外藥物控釋性能

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取一定量的5-FU/SAS，分別用pH=4.0、7.4為緩沖溶液定容配制儲(chǔ)備液，稀釋成具有一定梯度的溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定樣品最大吸收波長(zhǎng)處的紫外吸收值。以5-FU/SAS質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以最大吸收波長(zhǎng)處的紫外吸收值為縱坐標(biāo)，分別繪制5-FU/SAS在pH=4.0、7.4緩沖溶液中的工作曲線，從而得到線性擬合方程，用于定量計(jì)算。

1.4.2 體外藥物控釋性能

準(zhǔn)確移取5 mL質(zhì)量濃度為0.8 g/L的2種納米顆粒分散液，置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為7.0 kDa的透析袋中，加入25 mL PBS緩沖溶液作為釋放外液至離心管中。同時(shí)，將相同量的游離藥物溶于一定量緩沖溶液中，置于100 r/min的恒溫?fù)u床上對(duì)藥物進(jìn)行控釋實(shí)驗(yàn)。每隔一定時(shí)間從離心管中取出4.0 mL樣品溶液，并補(bǔ)加4.0 mL對(duì)應(yīng)緩沖液，研究藥物初始投加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、40%、50%)、溫度(25 ℃、37 ℃)以及釋放介質(zhì)pH(4.0、7.4)對(duì)體外藥物釋放性能的影響。測(cè)試所移取樣品溶液中5-FU在266 nm處、丹參素鈉在281nm處的紫外吸收值，根據(jù)工作曲線計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)藥物的累積釋放率(Er)；用零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、Korsmeyer Peppas模型以及Higuchi模型模擬藥物釋放行為，初步評(píng)價(jià)其釋藥機(jī)理。Er計(jì)算公式為

式中：Va為透析液的置換體積；Vb為釋放外液的總體積；Ci為第i次取樣時(shí)釋放液中藥物的濃度；mdrug為用于控釋的載藥納米顆粒中藥物的質(zhì)量；n為置換液的置換次數(shù)。

1.5 載藥殼聚糖納米顆粒的生物相容性

將DMEM培養(yǎng)液的pH調(diào)到7.2左右，過(guò)濾除菌，加入0.1 μm濾膜無(wú)菌過(guò)濾新生牛血清; 然后將L929細(xì)胞置于37 ℃的DMEM培養(yǎng)液中，在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h; 再將L929細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中以5 000細(xì)胞/孔接種;加入不同濃度的殼聚糖納米顆粒分散液，培養(yǎng)24 h后，用PBS溶液沖洗3次; 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及成長(zhǎng)情況，評(píng)價(jià)載藥殼聚糖納米顆粒的生物相容性。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖納米顆粒的紅外表征

殼聚糖納米顆粒的紅外光譜如圖2所示。

(a) 殼聚糖

(b) 殼聚糖納米顆粒圖 2 殼聚糖及殼聚糖納米顆粒紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of CS and CS nanoparticles

2.2 載藥殼聚糖納米顆粒的粒徑分布

2.2.1 質(zhì)量濃度的影響

聚電解質(zhì)復(fù)合法制備殼聚糖復(fù)合納米顆粒的形成主要包括3個(gè)步驟：靜電相互作用形成一級(jí)復(fù)合物，新鍵生成或聚合物鏈間相互扭曲形成穩(wěn)定復(fù)合物，疏水相互作用導(dǎo)致二級(jí)復(fù)合物間的聚集。以丹參素鈉為例，殼聚糖與聚合物不同濃度下納米顆粒粒徑大小如表1所示。

表 1 質(zhì)量濃度對(duì)粒徑的影響

由表1可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著質(zhì)量濃度的升高，平均粒徑有增大的趨勢(shì)。濃度太低時(shí)，可反應(yīng)的基團(tuán)少，靜電相互作用力弱，不易形成納米顆粒；而濃度太高時(shí)，殼聚糖的黏度增大，殼聚糖本身分子鏈的纏繞會(huì)影響與聚合物之間的相互作用。當(dāng)殼聚糖和聚合物質(zhì)量濃度在0.4～0.8 g/L時(shí)粒徑及其分布較好；質(zhì)量濃度大于0.8 g/L時(shí)，殼聚糖溶液趨于黏稠并伴有沉淀產(chǎn)生，納米顆粒粒徑分布不均勻。考慮到實(shí)際應(yīng)用，選擇質(zhì)量濃度為0.8 g/L制備載藥殼聚糖納米顆粒。

2.2.2 質(zhì)量比的影響

納米粒子的形成受靜電相互作用的控制，CS氨基與聚合物磺酸基團(tuán)之比是影響納米顆粒粒徑分布的主要因素之一。仍以丹參素鈉為例，納米顆粒粒徑在不同殼聚糖與聚合物質(zhì)量比下納米顆粒粒徑大小如表2所示。

表 2 質(zhì)量比對(duì)粒徑的影響

由表2可以看出，相同質(zhì)量濃度(0.8 g/L)條件下，滴加的聚合物量太少，質(zhì)量比小于10∶3時(shí)，溶液始終澄清，濃度太低，不足以使兩者形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)；隨著質(zhì)量比的增加，兩者交聯(lián)程度增加，形成納米顆粒的趨勢(shì)增加；但當(dāng)質(zhì)量比太大時(shí)，聚合物分子質(zhì)量的增加，可能會(huì)包裹在納米顆粒內(nèi)部，粒徑突然增大，最終導(dǎo)致沉淀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明CS和聚合物滴加比在10∶5～10∶7之間效果較佳。

2.2.3 藥物初始投加量的影響

藥物初始投加量對(duì)載5-FU以及載丹參素鈉殼聚糖納米顆粒粒徑大小如表3所示。

表 3 藥物投加量對(duì)粒徑的影響

由表3可以看出，隨著藥物初始投加量的增加，其平均粒徑有增大的趨勢(shì)，但其粒徑分布仍然比較均一，PdI值較小。另外，載丹參素鈉的殼聚糖納米顆粒粒徑比載5-FU體系略大，原因可能是由于丹參素鈉與殼聚糖分子間本身一定的靜電相互作用，使丹參素鈉負(fù)載量高，粒徑偏大。

與丹參素鈉體系不同，5-FU有質(zhì)子化和去質(zhì)子化的潛在位點(diǎn)，依賴于隨pH變化的中性、陽(yáng)離子和陰離子間的多重平衡，以至少4種互變異構(gòu)形式出現(xiàn)。5-FU在pH值3.1～4.5間帶正電荷；隨著pH值的增加，5-FU逐漸帶負(fù)電荷[31]。影響殼聚糖與聚合物之間的相互作用，從而影響粒徑和粒徑分布。在pH值為5.0附近，5-FU基本呈現(xiàn)電中性，而此時(shí)殼聚糖分子鏈上的氨基質(zhì)子化程度最高，與聚合物之間的靜電相互作用增強(qiáng)，納米顆粒結(jié)合相對(duì)緊密。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，制備載5-FU殼聚糖納米顆粒的最佳條件是質(zhì)量濃度為0.8 g/L，質(zhì)量比5∶3，此時(shí)可以形成粒徑大小在400 nm左右的納米載藥顆粒。不同初始藥物投加量下5-FU殼聚糖納米顆粒的粒徑分布如圖3所示。由圖3可知，隨著初始投加量的增加，載藥量隨之增加，其粒徑也逐漸增大。

(a) 30%

(b) 40%

(c) 50%圖 3 不同藥物投加量載5-FU的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of 5-FU with different drug dosage

2.3 負(fù)載藥殼聚糖納米顆粒的形貌表征

負(fù)載SAS/5-FU殼聚糖納米顆粒的TEM如圖4所示。

(a) SAS (b) 5-FU圖 4 負(fù)載SAS/5-FU殼聚糖納米顆粒的TEMFig.4 TEM images of SAS- and 5-FU-loaded CS nanoparticles

由圖4可以看出，納米顆粒分布均勻，分散性良好，呈致密球形結(jié)構(gòu)。其致密結(jié)構(gòu)可能歸因于殼聚糖質(zhì)子化的氨基與聚合物的磺酸基團(tuán)之間的強(qiáng)靜電相互作用。此外，負(fù)載SAS的CS納米顆粒的尺寸[圖4(a)]在300 nm左右，負(fù)載5-FU的CS納米顆粒[圖4(b)]的尺寸在250 nm左右。比DLS測(cè)定結(jié)果偏小，原因在于DLS測(cè)定的是水合粒徑。

2.4 載藥量和包封率的測(cè)定

2.4.1 載5-FU納米顆粒

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定5-氟尿嘧啶在1 mol/L HCl溶液中的工作曲線。擬合方程為

y=0.018+70.9x，R2=0.997

根據(jù)載藥量和包封率的計(jì)算公式，得到如表4所示結(jié)果。

表 4 藥物投加量對(duì)載5-FU載藥量和包封率的影響

由表4可以看出，隨著藥物初始投加量的增加，其載藥量和包封率都有所提高，一定程度上可以提高藥物利用率。

2.4.2 載丹參素鈉納米顆粒

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定丹參素鈉在1 mol/L HCl溶液中的工作曲線。擬合方程為

y=0.123+13.6x，R2=0.998

然后根據(jù)載藥量和包封率公式進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表5所示。

由表5可以看出，在藥物初始投加量小于40%時(shí)，隨著投加量的增加，載藥量和包封率都隨之增加。與載5-FU體系相比，載藥量和包封率均較高。可能是由于丹參素鈉在一定條件下帶負(fù)電，與質(zhì)子化的氨基間存在靜電相互作用，導(dǎo)致載藥量增大。與上述藥物投加量對(duì)粒徑的影響結(jié)果基本保持一致。而當(dāng)初始投加量大于40%后，載藥量和包封率反而有所下降。原因可能是由于納米顆粒內(nèi)部空間有限，幾乎達(dá)到飽和。

表 5 藥物投加量對(duì)SAS載藥量和包封率的影響

此外，這種聚電解質(zhì)復(fù)合法制備的納米藥物載體，更適宜負(fù)載一定條件下可以帶電的藥物分子，其載藥量和包封率大幅度增加。這是由于在載藥納米顆粒的形成過(guò)程中，不僅有殼聚糖的氨基與聚合物磺酸基團(tuán)之間的靜電相互作用，還存在藥物分子與殼聚糖/聚合物之間的相互作用，有利于載藥量和包封率的增加，也有利于藥物的釋放行為。

2.5 殼聚糖納米顆粒的藥物控釋性能

2.5.1 5-FU體外控釋性能

1) 游離藥物及載藥納米顆粒的體外藥物釋放。根據(jù)5-FU在pH=7.4緩沖溶液中的工作曲線,擬合方程為

y=0.040+58.0x，R2=0.998

可以計(jì)算游離藥物以及藥物投加量為40%的殼聚糖納米顆粒的累積釋放率，其累積釋放曲線及擬合圖如圖5所示。

(a) 零級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型

(b) 一級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型

(c) Korsmeyer-Peppas模型

(d) Higuchi模型圖 5 游離藥物及載藥納米顆粒的控制釋放曲線及模型擬合Fig.5 Controlled release profiles of free drug and drug-loaded nanoparticles

由圖5可以看出：游離藥物累積釋放速率較快，2 h釋放了70%以上；與游離藥物相比，殼聚糖載藥體系藥物控釋速率明顯較慢，前1 h的突釋是由于吸附在納米顆粒表面的藥物所導(dǎo)致，隨后實(shí)現(xiàn)了緩慢釋放。可能是由載體基質(zhì)的降解和藥物從聚合物基質(zhì)的緩慢擴(kuò)散引起的。10 h僅釋放50%左右，說(shuō)明殼聚糖載藥納米顆粒有明顯的藥物控釋效果。藥物在體內(nèi)的突然釋放可迅速達(dá)到有效治療濃度，而持續(xù)釋放可使藥物停留在有效治療濃度范圍。用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Korsmeyer-Peppas以及Higuchi模型分別進(jìn)行了模擬。可以看出：游離藥物的釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，以藥物分子的擴(kuò)散釋放為主，而載藥納米顆粒更符合Korsmeyer-Peppas模型，擬合度最高，擴(kuò)散指數(shù)n<0.45。說(shuō)明藥物的釋放為Fick擴(kuò)散，溶劑滲透控制釋放速率，而釋放速率取決于釋放介質(zhì)pH以及納米顆粒和藥物之間的相互作用。

2) 釋放介質(zhì)pH對(duì)體外藥物控釋的影響。根據(jù)5-FU在pH=4.0緩沖溶液中的工作曲線，擬合方程為

y=0.001 5+56.6x，R2=0.998

以及pH=7.4緩沖溶液中的工作曲線，可以計(jì)算當(dāng)藥物初始投加量為40%時(shí)，37 ℃條件下，不同釋放介質(zhì)pH下的累積釋放率，如圖6所示。

(a) 零級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型

(b) 一級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型

(c) Korsmeyer-Peppas模型

(d) Higuchi model模型圖 6 pH釋放介質(zhì)對(duì)藥物控釋性能的影響及藥物模型模擬Fig.6 Effects of pH medium on the controlled release properties and drug model simulation

由圖6可以看出，在1 h左右，各pH條件下5-FU的釋放速度都較快。可能是由于表面吸附一定量的藥物導(dǎo)致開(kāi)始有突釋現(xiàn)象。1 h以后，釋放介質(zhì)為pH=4.0條件下釋藥速度較快?？赡苁怯捎谠诖藯l件下，聚合物離子化程度降低，電荷密度下降，使納米顆粒結(jié)構(gòu)較為松散。此外，pH=4.0時(shí)，5-FU可能帶正電荷，與殼聚糖氨基之間的排斥作用，使得藥物分子擴(kuò)散速度較快，一級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型擬合度較高；而在pH=7.4時(shí)，Korsmeyer Peppas模型擬合度最高。

3) 藥物初始投加量對(duì)藥物控釋的影響。當(dāng)釋放介質(zhì)為pH=7.4緩沖溶液、37 ℃條件下，不同藥物初始投加量(30%、40%、50%)對(duì)殼聚糖納米顆粒藥物控釋性能的影響如圖7所示。

圖 7 不同藥物初始投加量對(duì)藥物控釋性能的影響Fig.7 Effects of different initial dosage of drugs on controlled release properties

由圖7可以看出，在相同條件下，藥物初始投加量低的載藥體系，累積釋放率較高，說(shuō)明藥物的釋放量與其載藥量有關(guān)。這是由于初始投加量低時(shí)，載藥量低，藥物分子更容易從納米顆粒中釋放出來(lái)；另外，此時(shí)納米顆粒粒徑較小，比表面積較大，在透析介質(zhì)中逐漸結(jié)構(gòu)疏松，導(dǎo)致累積釋放率增大。

4) 溫度對(duì)藥物控釋的影響。當(dāng)釋放介質(zhì)為pH=7.4緩沖溶液、藥物初始投加量為50%時(shí)，不同溫度(25 ℃、37 ℃)對(duì)殼聚糖納米顆粒藥物控釋性能的影響如圖8所示。

圖 8 溫度對(duì)藥物控釋性能的影響Fig.8 Effect of temperature on controlled release properties of chitosan nanoparticles

由圖8可以看出：37 ℃時(shí)殼聚糖納米顆粒釋藥速度明顯大于在25 ℃，2 h內(nèi)釋藥達(dá)到25%；而在25 ℃時(shí)，殼聚糖納米顆粒2 h釋藥為15%。這可能是由于溫度較高，載藥納米顆粒結(jié)構(gòu)逐漸松散，使藥物更容易釋放出來(lái)。從另外一個(gè)角度分析，本文所使用的聚合物為溫度敏感性聚合物，臨界溫度大約在34～37 ℃。在此溫度下，聚合物分子鏈會(huì)更疏松，與殼聚糖結(jié)合力減弱，使藥物更容易擴(kuò)散。生理?xiàng)l件下釋放較快，低溫條件下釋放速度緩慢，更易于其實(shí)際應(yīng)用。

2.5.2 丹參素鈉體外控釋性能

1) 釋放介質(zhì)pH對(duì)體外藥物控釋的影響。根據(jù)丹參素鈉在pH=4.0緩沖溶液中的工作曲線，擬合方程為

y=0.042+327.1x，R2=0.996

pH=7.4緩沖溶液中的工作曲線,擬合方程為

y=0.132+11.4x，R2=0.998

可以計(jì)算當(dāng)藥物初始投加量為40%，37 ℃條件下，不同釋放介質(zhì)pH下的藥物累積釋放率，如圖9所示。

(a) 零級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型

(b) 一級(jí)動(dòng)力學(xué)釋放模型

(c) Korsmeyer-Peppas模型

(d) Higuchi模型圖 9 pH釋放介質(zhì)對(duì)藥物控釋性能的影響及藥物模型模擬Fig.9 Effects of pH medium on the controlled release properties and drug model simulation

由圖9可以看出，與載5-FU體系不同，SAS體系在pH=7.4條件下釋放較快。這是因?yàn)榈⑺剽c是一種酸性藥物且水溶性受pH值的影響較大。在pH=4.0下，殼聚糖分子鏈上的氨基質(zhì)子化程度提高，與帶負(fù)電的藥物丹參素鈉一級(jí)聚合物間的靜電相互作用力更強(qiáng)，結(jié)合更緊密，阻礙了釋放介質(zhì)的滲透以及藥物的釋放，從而釋放速率相對(duì)較慢。此時(shí)Korsmeyer-Peppas模型擬合度最高，以Fick擴(kuò)散為主；而pH=7.4下，一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合度最高，以分子擴(kuò)散為主。此外，在pH=4.0條件下，24 h后藥物累積釋放率達(dá)到55%左右。說(shuō)明這種方法構(gòu)建的殼聚糖納米載藥體系不僅具有控釋作用，也有一定的緩釋作用，預(yù)計(jì)其可以減少給藥次數(shù)，提高藥物利用率。

2) 藥物初始投加量對(duì)藥物控釋的影響。當(dāng)釋放介質(zhì)為pH=7.4緩沖溶液，37 ℃下，不同藥物初始投加量(30%、40%、50%)對(duì)殼聚糖納米顆粒藥物控釋性能的影響如圖10所示。

圖 10 藥物初始投加量對(duì)藥物控釋性能的影響Fig.10 Effects of different initial dosage of drugs on controlled release properties

由圖10可以看出：丹參素鈉在不同的投藥量下的累積釋放率與初始投加量的關(guān)系很緊密，當(dāng)初始投加量是40%時(shí)，累積釋放率最快。這與載藥體系的載藥量和包封率以及藥物本身的屬性有一定的聯(lián)系：對(duì)于載丹參素鈉體系，其初始投加量為40%時(shí)，載藥量最高，粒徑較大，藥物釋放所需要的阻力小。

3) 溫度對(duì)藥物控釋的影響。當(dāng)釋放介質(zhì)為pH=7.4緩沖溶液、藥物初始投加量為50%時(shí)，不同溫度(25 ℃、37 ℃)對(duì)殼聚糖納米顆粒藥物控釋性能的影響如圖11所示。

圖 11 溫度對(duì)藥物控釋性能的影響Fig.11 Effect of temperatures on controlled release properties

由圖11 可以看出，溫度對(duì)載丹參素鈉與載5-FU的殼聚糖納米顆粒釋藥性能的影響相同。37 ℃時(shí)，載丹參素鈉殼聚糖納米顆粒釋放速度較快；低溫下釋放速度較慢，便于保存，更有利于實(shí)際應(yīng)用。

2.6 載藥殼聚糖納米顆粒的生物相容性

在倒置顯微鏡下觀察載藥殼聚糖納米顆粒與細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞形態(tài)變化，結(jié)果如圖12所示。

(a) 5-FU (b) SAS (c) 苯酚溶液圖 12 細(xì)胞形態(tài)倒置顯微鏡照片F(xiàn)ig.12 Inverted microscope photos of cells

從圖12可以看出：以苯酚溶液為對(duì)比樣品，發(fā)現(xiàn)對(duì)比樣品使細(xì)胞變形或塌縮，大部分是死細(xì)胞；而載藥殼聚糖納米顆粒體系圖12(a)、(b)的細(xì)胞形態(tài)良好，呈梭形或多角形，胞體飽滿，表明載藥殼聚糖納米顆粒生物相容性良好。

3 結(jié) 論

1) 對(duì)于載5-氟尿嘧啶體系，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 g/L，質(zhì)量比為5∶3時(shí)，可以形成粒徑382 nm的殼聚糖納米顆粒；對(duì)于載丹參素鈉體系，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 g/L，質(zhì)量比為10∶7時(shí)，可以形成粒徑425 nm的殼聚糖納米顆粒。隨著投藥量的增加，平均粒徑有增大趨勢(shì)，載藥量與包封率也隨之增大。

2) 與游離藥物相比，對(duì)于載5-氟尿嘧啶體系，載藥納米顆粒有明顯的控釋效果。初始投加量越低，pH越小，溫度越高，釋放速率越快；對(duì)于載丹參素鈉體系，初始投加量越高，pH越大，溫度越高，釋放速率越快。不同的藥物，控釋效果與釋放動(dòng)力學(xué)模型擬合不同。

3) 通過(guò)聚電解質(zhì)復(fù)合法構(gòu)建的殼聚糖納米載藥體系，更適宜負(fù)載一定條件下帶電的藥物分子，其載藥量和包封率會(huì)有所提高，且藥物的控制釋放行為更明顯。

4) 載藥殼聚糖納米顆粒生物相容性良好，符合生物醫(yī)用材料的基本要求。