硝酸鑭對臍橙葉片抗氧化酶活性的影響*

高柱，陳璐，毛積鵬，盧玉鵬，張小麗，樊志鵬，王小玲

（1 江西省科學院生物資源研究所，南昌330096）（2 井岡山生物技術研究院）

我國擁有豐富的稀土礦產資源，稀土元素齊全，成礦條件優(yōu)越，儲量居世界首位，是名副其實的稀土資源大國[1-2]。稀土農用是我國重要的創(chuàng)新之舉，也是我國具有特色的研究成果之一，其施用方法簡便且經濟效益顯著，在糧食[3]、水果[4]、蔬菜[5]等作物上得到了較為廣泛的應用。稀土元素具有獨特的理化性質和生理活性，可與質膜上的生物大分子如蛋白、磷脂等結合形成比較穩(wěn)定的復合物，從而影響植物體內生理生化代謝過程[6]。

稀土元素在農業(yè)上的應用可歸納為以下3 個方面。一是促進植物生長發(fā)育。施用適當濃度的稀土元素可以打破種子休眠、促進種子萌發(fā)、促進植物芽和根系的生長；水稻[7]、小麥[8]、丹參[9]種子播種前經硝酸稀土浸泡處理后，顯著提高了種子發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)，同時促進了小麥苗期旺盛生長、丹參幼苗干物質積累與莖葉生長。二是減輕脅迫傷害，提高植物抗性。一方面，稀土離子能夠提高滲透調節(jié)物質的積累和細胞膜的保護功能，維持細胞膜的通透性和穩(wěn)定性，增強作物對逆境或脅迫的抵抗能力[10]；另一方面稀土離子可以調節(jié)植物自身抗氧化酶活性，清除過多活性氧與自由基，緩解不良環(huán)境造成的損傷[11-12]。硝酸稀土處理藜麥幼苗后提高了抗氧化酶活性，調節(jié)了滲透物質含量，緩解了鹽脅迫的損傷[13]。三是提高產量，改善品質。施用適當濃度的稀土元素可以提高植物對養(yǎng)分的吸收、轉化和利用效率，還可促進植物自身葉綠素形成、增強光合效率，為提高產量與改善品質奠定物質基礎。適宜濃度的硝酸稀土處理甜瓜[14]、草莓[15]后，明顯提高了單果重和維生素C 含量，甜瓜果實可溶性固形物、可溶性糖含量也得到了提高。

鑭與其他稀土元素相比，具有化學性質活潑、水合半徑離子小、生物活性高等特性，被認為是作物的生理活性物質，在調節(jié)植物生理活動中起到重要作用[16]。植物在逆境脅迫條件下，增強酶促防御系統(tǒng)中保護酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸氧化酶（APX）等抗氧化酶，可清除植物體內的活性氧及自由基，緩解脅迫傷害[2]。稀土元素鑭不僅可以調節(jié)植物生長，還能促進逆境條件下保護酶活性的增加、降低細胞膜過氧化作用下丙二醛的產生，增強植物抵御逆境能力[12]。鑭的合理使用對植物生長發(fā)育和品質改善具有明顯促進作用，研究表明，稀土元素鑭對植物生理調控表現(xiàn)出“低濃度硝酸鑭促進、高濃度硝酸鑭抑制”效應，高濃度硝酸鑭處理時鑭的重金屬特性會抑制植物體內特定酶或結合蛋白的活性，甚至產生毒害作用[17]。

由于稀土元素鑭在植物中的作用機理較為復雜，不同植物對稀土元素鑭濃度的耐受性不盡相同，因此，不同植物及其組織、器官的最佳使用濃度還需要不斷探索。本研究以2 年生紐荷爾臍橙嫁接苗為試驗材料，采用不同濃度的硝酸鑭溶液噴施葉片，通過測定噴施后24 h內不同時間段臍橙葉片中抗氧化酶（SOD、POD、CAT、GR 和APX）的活性，研究其活性變化規(guī)律，分析不同濃度稀土元素鑭對臍橙葉片抗氧化酶活性的影響，為稀土元素的合理使用及其對臍橙生理代謝及品質調控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在江西省科學院園藝植物高值利用研究室奉新試驗基地（海拔64.35 m，北緯28°40′17″，東經115°18′31″）進行。試驗材料為2 年生紐荷爾臍橙嫁接苗，于2020 年2 月移栽至口徑60 cm、底徑31 cm、高35 cm 的花盆中，每盆栽植1 株嫁接苗。供試盆栽土取自基地耕作層，將土壤混勻之后，每盆裝10 kg 土進行移栽定植。

1.2 試驗方法

試驗設置4 個處理：50、150、300 mg/L 硝酸鑭處理，以噴施等量清水為對照（CK）。2020 年7月中旬，選擇晴朗天氣的8：00 噴施，每個處理噴施5 株幼樹，3 次重復。于噴施當天8：00、10：00、12：00、16：00、20：00 和次日8：00（處理時間記錄為0、2、4、8、12、24 h）采集植株中上部當年生嫩葉。將采集的葉片剪碎混勻，液氮冷凍后-80 ℃保存待測。

1.3 測定項目與方法

稱取臍橙葉片樣品1.0 g，液氮研磨，加入9 mL PBS 緩沖液（10 mol/L，pH 值7.2）勻漿抽提10 min。將制備好的10%勻漿液在4 ℃條件下離心20 min（8 000 r/min），取上清液置冰上待測[18]。葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT、GR、APX 活性均采用上海優(yōu)選生物科技有限公司的ELISA 檢測試劑盒進行測定，3 次重復。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)及制圖，采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同濃度硝酸鑭處理對臍橙葉片SOD 活性的影響

SOD 廣泛存在于動植物和微生物中，能將超氧化物陰離子自由基O2-迅速歧化為過氧化氫和分子氧，是在清除活性氧過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶[19]。如圖1 所示，CK 的臍橙葉片SOD 活性在24 h 內呈升高的趨勢，而3 個硝酸鑭處理的葉片SOD 活性均呈先升高后降低的趨勢，且峰值均出現(xiàn)在處理后4 h，此時，50、150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片SOD 活性分別為13.85、14.23 U/g，均顯著高于CK，300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片SOD 活性與CK 無顯著差異。在處理后12 h，3 個硝酸鑭處理的葉片SOD 活性均低于CK，其中300 mg/L 硝酸鑭處理差異達顯著水平。說明50、150 mg/L 硝酸鑭處理前期可促進葉片SOD 活性的增加，加快活性氧的清除并降低自由基傷害，而300 mg/L 硝酸鑭處理對葉片SOD 活性的調節(jié)作用不明顯。

圖1 不同濃度硝酸鑭處理葉片SOD 活性的變化

2.2 不同濃度硝酸鑭處理對臍橙葉片POD 活性的影響

POD 是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，具有調節(jié)自由基和活性氧濃度而防止膜脂過氧化的作用，是一種重要的防御保護酶[20]。如圖2所示，所有處理的葉片POD 活性在24 h 內均呈先升高后降低的趨勢，3 個硝酸鑭處理葉片POD 活性峰值與CK 相比均有所提前，150、300 mg/L 硝酸鑭處理的峰值提前8 h，50 mg/L 硝酸鑭處理的峰值提前4 h。處理后2、4 h，3 個硝酸鑭處理葉片POD活性均顯著高于CK，且以300 mg/L 硝酸鑭處理最高；處理后8、12、24 h，50 mg/L 硝酸鑭處理葉片POD 活性均高于其他處理，且均顯著高于150、300 mg/L 硝酸鑭處理。說明硝酸鑭處理能改變臍橙葉片POD 活性變化規(guī)律，150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片POD 活性下降最快。

圖2 不同濃度硝酸鑭處理葉片POD 活性的變化

2.3 不同濃度硝酸鑭處理對臍橙葉片CAT 活性的影響

CAT 存在于細胞的過氧化物體內，專一催化底物過氧化氫分解成氧和水[21]，在清除活性氧、維持活性氧代謝平衡方面具有重要作用[22]。從圖3 可以看出，50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性呈升高—降低—升高的趨勢，150 mg/L 硝酸鑭處理呈先降低后升高的趨勢，而300 mg/L 硝酸鑭處理呈降低—升高—降低的趨勢。CK 的葉片CAT 活性最低值（1.28 U/g）出現(xiàn)在處理后8 h，分別是50、150、300 mg/L 硝酸鑭處理的53.56%、61.24%和35.75%。50、150 mg/L 硝酸鑭處理的最低值和300 mg/L 硝酸鑭處理的峰值均出現(xiàn)在處理后12 h。處理后2、4 h，50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著高于其他處理；處理后8、12 h，300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著高于其他處理；處理后24 h，3 個硝酸鑭處理的葉片CAT 活性均顯著低于CK。表明50 mg/L 硝酸鑭處理前期可促進CAT 活性的升高，而300 mg/L 硝酸鑭處理后期可促進CAT 活性的升高。

圖3 不同濃度硝酸鑭處理葉片CAT 活性的變化

2.4 不同濃度硝酸鑭處理對臍橙葉片GR 活性的影響

由圖4 可以看出，3 個硝酸鑭處理均提高了葉片GR 活性，且隨處理時間的延長均呈先升高后降低的趨勢，峰值均出現(xiàn)在處理后4 h，其中150、300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片GR 活性始終顯著高于CK。隨著硝酸鑭處理濃度的升高，葉片GR 活性呈升高趨勢，最高值出現(xiàn)在300 mg/L 硝酸鑭處理后4 h，達26.08 U/g，是CK 的2.45倍，此時，150、300 mg/L硝酸鑭處理的葉片GR 活性均顯著高于50 mg/L 硝酸鑭處理?？梢?，硝酸鑭具有提高葉片GR 活性的作用，且硝酸鑭濃度越高其促進作用越顯著。

圖4 不同濃度硝酸鑭處理葉片GR 活性的變化

2.5 不同濃度硝酸鑭處理對臍橙葉片APX 活性的影響

由圖5 可知，3 個硝酸鑭處理均降低了葉片APX活性，其中50、150 mg/L 硝酸鑭處理的降低效果更明顯，且主要出現(xiàn)在處理后4～12 h；CK 和300 mg/L硝酸鑭處理均呈先升高后降低的趨勢，處理后4 h，50、150、300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片APX 活性分別為CK（17.25 U/g）的39.07%、39.13%和56.12%。硝酸鑭處理濃度的升高對葉片APX 活性的影響表現(xiàn)為前期（處理后2 h）小、后期大，處理后4～24 h，3 個硝酸鑭處理的葉片APX 活性均顯著低于CK，其中，150 mg/L 硝酸鑭處理對葉片APX 活性的抑制效果最為明顯。

圖5 不同濃度硝酸鑭處理葉片APX 活性的變化

3 討論與結論

植物長期進化形成一套成熟的抵御逆境脅迫的抗氧化系統(tǒng)[23]，正常條件下，植物通過抗氧化劑與抗氧化酶系統(tǒng)共同維持細胞內活性氧代謝的動態(tài)平衡[24]。植物受到脅迫時，細胞穩(wěn)態(tài)遭到破壞，誘導產生超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫、脂類過氧化物等化學性質活潑的活性氧，當體內積累大量活性氧時，抗氧化酶系統(tǒng)啟動自我防御功能，通過調節(jié)抗氧化酶活性清除過多的活性氧，以維持體內活性氧產生與清除的動態(tài)平衡，控制膜過氧化程度，增強脅迫抵御能力[25]。

3.1 硝酸鑭處理濃度對抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、CAT 的協(xié)同作用組成了植物防御系統(tǒng)中的一個抗氧化鏈條[26]。SOD 在活性氧清除過程中首先發(fā)揮作用，將超氧化物陰離子迅速歧化為過氧化氫和分子氧，而歧化反應產生的過氧化氫會立即被POD 和CAT 分解為完全無害的水，從而降低自由基對細胞造成的功能性傷害[27]。不同濃度硝酸鑭處理在不同時間段對臍橙葉片中SOD、POD、CAT 活性的影響差異較大。葉片SOD 活性在處理后4 h 出現(xiàn)峰值，且隨著處理濃度的升高呈先升高后降低的趨勢，150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片SOD 活性最高。300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片POD 活性峰值出現(xiàn)在處理后4 h，而50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片POD活性峰值出現(xiàn)在處理后8 h，且均顯著高于其他處理。葉片CAT 活性在處理后表現(xiàn)出顯著差異，處理后2 h，50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著高于CK，300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著低于CK，而150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性與CK 無顯著差異，說明硝酸鑭對臍橙葉片中抗氧化酶活性同樣顯現(xiàn)了“低濃度硝酸鑭促進、高濃度硝酸鑭抑制”的效應[17]。硝酸鑭處理能夠提高抗氧化酶活性，加快活性氧與丙二醛的清除，從而降低膜脂的過氧化，起到保護細胞膜結構的作用。在本研究中，能夠促進葉片SOD 活性增加的適宜硝酸鑭濃度為150 mg/L，而促進葉片POD 和CAT 活性增加的適宜硝酸鑭濃度為50 mg/L。

抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)作為植物清除活性氧的通路之一，通過調控抗氧化非酶物質含量和抗氧化酶活性來減輕氧化應激損傷，在植物應對脅迫時的防御體系中扮演重要角色[20]。GR 和APX 是AsA-GSH 循環(huán)中的主要酶系，維持氧化還原水平、保護葉綠體和其他細胞組分免受活性氧的毒害，從而提高植物氧化脅迫的耐受性[28]。本研究中，葉片GR 活性隨硝酸鑭處理濃度的升高而升高，且大多數(shù)時期顯著高于CK，處理后4 h 出現(xiàn)峰值，其中300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片GR 活性最高達26.08 U/g。提高葉片GR 活性有助于維持或增加細胞內谷胱甘肽含量，以維系膜蛋白結構的穩(wěn)定性[29]。本研究表明，不同濃度硝酸鑭處理的葉片APX 活性大多數(shù)時期顯著低于CK，50、150 mg/L 硝酸鑭處理對葉片APX 活性的降低效果更明顯。高活性APX會降低抗壞血酸含量，在AsA-GSH 循環(huán)中APX 以抗壞血酸為電子供體，還原過量的過氧化氫，硝酸鑭處理后降低了臍橙葉片APX 活性，低活性APX更有利于維持細胞內抗壞血酸含量及氧化還原的平衡[30]。硝酸鑭處理可降低臍橙葉片APX 活性、提高葉片GR 活性，該結論與Shan等[15,31]、李進等[29]的研究結論一致?？箟难?、谷胱甘肽等非酶促抗氧化劑直接與活性氧接觸發(fā)生反應，同時還可作為活性氧清除的催化劑，加速活性氧清除過程[31]，平衡細胞內AsA/DHA、GSH/GSSG 氧化還原水平，低活性APX 可減少抗壞血酸降解，高活性GR 可促進谷胱甘肽合成，能夠減輕不利環(huán)境對臍橙葉片造成的傷害。因此，能夠提高臍橙葉片GR 活性的適宜硝酸鑭濃度為300 mg/L，而降低APX 活性的適宜硝酸鑭濃度為150 mg/L。

研究表明，稀土元素鑭對植物生長發(fā)育的影響取決于濃度，過量的鑭將抑制植物生長、破壞細胞結構和擾亂生理代謝；低濃度的鑭可以促進根系生長、種子萌發(fā)、莖葉生長以及介導次生代謝、調節(jié)氮同化等，同時可以緩解植物環(huán)境脅迫下的氧化損傷[32]。本研究結果顯示，300 mg/L 硝酸鑭處理促進了葉片GR 活性升高，抑制了SOD 活性增加；150 mg/L 硝酸鑭處理提高SOD 活性的效果最佳，同時對葉片APX 活性的抑制效果最好；50 mg/L 硝酸鑭處理提高了葉片POD 活性，對葉片APX 活性的抑制效果明顯優(yōu)于300 mg/L 硝酸鑭處理，同時在處理前期提高了葉片CAT 活性，這可能與抗氧化酶參與的生理代謝調控途徑不同有關。

3.2 硝酸鑭處理時間對抗氧化酶活性的影響

硝酸鑭處理臍橙葉片的時間長短對SOD、POD、CAT、GR 活性的影響差異較大，3 個硝酸鑭處理的葉片SOD 活性均在處理后4 h 出現(xiàn)峰值；300 mg/L硝酸鑭處理的葉片POD 活性在處理后4 h 出現(xiàn)峰值，而50 mg/L 硝酸鑭處理POD 活性峰值出現(xiàn)在處理后8 h；50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性峰值出現(xiàn)在處理后2 h，300 mg/L 硝酸鑭處理的峰值出現(xiàn)在處理后12 h；3 個硝酸鑭處理的葉片GR 活性峰值出現(xiàn)在處理后4 h。

綜上所述，硝酸鑭處理能夠促進臍橙葉片抗氧化能力的提高，通過抗氧化酶和抗氧化劑共同作用，維持細胞內活性氧產生與消除的動態(tài)平衡，增強臍橙葉片對環(huán)境脅迫的耐受性。