壯藥白花九里明提取物對(duì)大鼠子宮纖溶系統(tǒng)的影響

楊 宏 那襲雪 韓 璐 宋 丹 談遠(yuǎn)峰 韋 威 張文濤 寧小清

壯藥白花九里明提取物對(duì)大鼠子宮纖溶系統(tǒng)的影響

楊 宏 那襲雪 韓 璐 宋 丹 談遠(yuǎn)峰 韋 威 張文濤 寧小清

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

目的：通過對(duì)大鼠子宮病理切片的觀察以及檢測(cè)子宮組織中tPA，PAI-1的表達(dá)，探討壯藥白花九里明提取物在纖溶系統(tǒng)方面的止血機(jī)制。方法：對(duì)健康的成年或未妊娠雌性老鼠構(gòu)建不完整子宮流產(chǎn)模型，然后隨機(jī)分成5組，每組10只，依次是白花九里明提取物低用量，白花九里明提取物中用量，白花九里明提取物高劑量，空白，模型，咖啡酸組6組。取子宮組織。進(jìn)行組織病理切片的觀察，并用免疫組化的方法測(cè)定子宮組織中tPA，PAI-1的表達(dá)。結(jié)果：tPA組經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，=0.092＞0.05，方差齊。使用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較，與正常組比較，模型組和和白花九里明低劑量組tPA水平均顯著增加，＜0.05。與模型組比較，咖啡酸組、白花九里明低劑量組、白花九里明高劑量組tPA水平顯著降低，＜0.05。白花九里明低劑量組和高劑量組之間比較，高劑量組較低劑量組tPA水平顯著降低，＜0.01。PAI-1組經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，=0.056＞0.05，表明方差齊。與正常組比較，白花九里明低劑量組PAI-1水平均顯著增加，＜0.05。與模型組比較比較，咖啡酸組，白花九里明低劑量組、高劑量組PAI-1水平均顯著增加，＜0.05。結(jié)論：白花九里明提取物具有促進(jìn)子宮止血的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)子宮纖溶系統(tǒng)相關(guān)。

白花九里明；子宮；病理切片；tPA；PAI-1

引言

隨著我國(guó)“二胎”“三胎”政策的開放，產(chǎn)婦尤其是高齡產(chǎn)婦比例大幅度升高。我國(guó)孕婦、產(chǎn)婦的死亡率不斷上升。而產(chǎn)后出血正是導(dǎo)致死亡發(fā)生的首要原因。因此，如何促進(jìn)出血后的止血，減少并發(fā)癥的危害，已成為亟待解決的問題。壯藥白花九里明來源于菊科艾納香屬植物東風(fēng)草［(Randeria)Chang et Tseng］的地上部分，壯族民間常用于治療產(chǎn)后出血過多[1]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明壯藥白花九里水煎液具有止血作用，且具有多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，表現(xiàn)在具有可以增加大鼠子宮平滑肌的收縮活力、收縮頻率和平均張力，從而促進(jìn)子宮收縮而應(yīng)用于婦產(chǎn)科止血[2]。增加血小板細(xì)胞的數(shù)量、聚集性以及粘附性。影響大鼠凝血酶原時(shí)間、影響活化部分凝血酶持續(xù)時(shí)間、凝血酶時(shí)間和纖維蛋白原也等[3,4]。前期研究還表明，咖啡酸為白花九里明發(fā)揮止血作用的有效成分，為了進(jìn)一步明確白花九里明的婦科止血機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬通過造大鼠產(chǎn)后出血模型，并用咖啡酸以及白花九里明干預(yù)后，觀察大鼠子宮組織的病理影響和測(cè)量子宮組織中t-PA、PAI等來說明壯藥白花九里明提取物對(duì)大鼠纖溶系統(tǒng)的影響。

1 材料

1.1 藥材藥品與提取物

白花九里明藥材采自南寧市市郊，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)朱毅麟高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為菊科艾納香屬植物東風(fēng)草［(Randeria)Chang et Tseng］地上部分。提取物由藥材加水超聲提取，濾過，濾液濃縮后加入乙醇使含醇量為70%～85%，靜置，濾過，濾液干燥后即得。

1.2 試劑

咖啡酸片（德州德藥制藥有限公司，批號(hào)：H 37020537）；米非司酮片（湖北葛店人福藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H 20033551）；米索前列醇片（湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司批號(hào)：H 20073696）；水合氯醛（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：302-17-0）；無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10009218）二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10023418）；3%H2O2（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10011218）；封閉山羊血清（Solarbio批號(hào)：SL038-10 mL）；DAB顯色試劑盒（Solarbio批號(hào)：DA1010-2*3 mL）；蘇木素（Solarbio批號(hào)：G1140）；中性樹脂（Solarbio批號(hào)：G8590）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，SPF級(jí)，雌雄比例為1∶1，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0011，采購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。試驗(yàn)前，對(duì)動(dòng)物適宜喂食一個(gè)星期。

1.4 儀器

P2、P10、P20、P100、P200、P1000正置顯微鏡（上海市徠卡顯微系統(tǒng)股份公司）；DHG-9023A移液管（吉爾森P型移液管股份公司）；TKD-TSB恒溫電烤箱（上海市恒一科學(xué)儀器股份公司）；TB-718D組織脫水機(jī)（湖北康強(qiáng)醫(yī)療儀器公司）；RM2235石蠟包埋法機(jī)械（湖北省泰維科學(xué)實(shí)業(yè)股份公司）；TB-718L石蠟切片機(jī)（美國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)股份公司）；TKD-TK生物組織包埋機(jī)械-冷凍機(jī)（美國(guó)泰維科技公司）；P2、P10、P20、P100、P200、P1000攤片烤片機(jī)（湖北省康強(qiáng)醫(yī)療儀器公司）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 動(dòng)物造模

參照王曉東等的方法[5]造模。選擇重量為250 g～300 g的Wistar老鼠，雌雄比例各半，SPF級(jí)，首先選擇正在動(dòng)情期老鼠，按雌性-雄性1∶1的比率合籠，在第二天上午進(jìn)行女性陰道涂片試驗(yàn)，在顯微鏡下若看到有精液或陰道內(nèi)栓即為懷孕第一天，再選擇二十只尚未懷孕的老鼠，作為空白對(duì)照組，最后選擇已妊娠的成功老鼠一百只，隨即分成五組，每組二十只，進(jìn)行灌胃給藥。即模型組、陽(yáng)性組（咖啡酸10 mg/kg）白花九里明高（9.6 g/kg），中（4.8 g/kg），低（2.4 g/kg）劑量組。各組分別在懷孕第七天，在上午八點(diǎn)灌胃治療用米非司酮水溶液（12 mg/kg）和晚上六點(diǎn)灌胃米索前列醇水溶液（120 μg/kg），以形成早孕大鼠的不完全流產(chǎn)或子宮內(nèi)出血模型。持續(xù)給藥七日。

2.2 取材

最后一次給藥后2 h，所有大鼠以3 mL/kg大麻醉劑量腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，取出子宮組織，置于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)過包埋、切片、脫蠟、復(fù)水等過程，再經(jīng)伊紅-蘇木素（HE）染色，用于組織病理學(xué)檢測(cè)；按照免疫組化的方法測(cè)定tPA和PAI-1的表達(dá)，顯微鏡觀察拍照。

2.3 結(jié)果判定

PAI-1、tPA的染色陽(yáng)性表現(xiàn)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞膜內(nèi)存在褐黃色顆粒且強(qiáng)度超過背景值為準(zhǔn)，在拍攝的四百倍鏡下具有典型細(xì)胞染色區(qū)域。依染料深淺確定陽(yáng)性強(qiáng)弱，在光鏡下逐張切片分析圖像，估計(jì)每單位體積的染色區(qū)域平均光密度（mean opticaldensity，mean OD），取平均值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，用光密度值除以面積，來測(cè)定單位面積處的平均光密度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用spss.21應(yīng)用軟件完成統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，結(jié)論以均數(shù)的±標(biāo)準(zhǔn)差（±）顯示，采取配對(duì)檢測(cè)的方式進(jìn)行檢驗(yàn)；組間對(duì)比使用單因方差分析，當(dāng)數(shù)據(jù)結(jié)果不符合正態(tài)分配或方差齊性時(shí)，則使用秩和檢驗(yàn)分析的方法，組間兩兩對(duì)比采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 白花九里明提取物對(duì)大鼠子宮組織的影響

白花九里明提取物對(duì)大鼠子宮組織的影響如圖1所示，a為正常組子宮，其內(nèi)膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，粘膜層內(nèi)腺體細(xì)胞核、細(xì)胞形態(tài)均正常，核排列整齊且朝向基底膜，間質(zhì)細(xì)胞分布密集，b為模型組內(nèi)膜細(xì)胞不完整，腺體細(xì)胞排列疏松且不規(guī)則，部分核皺縮甚至消失，血管數(shù)量減少，有水腫以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與正常組相比有明顯差異，表明造模成功。c為咖啡酸組較模型組腺體細(xì)胞趨于正常，血管數(shù)量明顯增加，子宮內(nèi)膜相對(duì)完整；d為白花九里明低劑量組整體腺體疏松不規(guī)則，血管數(shù)量增加，e、f為白花九里明中、高劑量組與模型組相比，肌層細(xì)胞排列緊密，腺體細(xì)胞趨于正常，滲出物減少。

a正常組；b模型組；c咖啡酸組；d百花九里明低劑量組；e百花九里明中劑量組；f百花九里明高劑量組

3.2 白花九里明提取物對(duì)大鼠子宮組織tPA和PAI-1的影響

運(yùn)用免疫組化的方法測(cè)量子宮組織中tPA和PAI-1的含量如圖2、圖3所示，用Image ProPlus半定量法計(jì)算tPA和PAI-1的表達(dá)量如表1所示。

a正常組；b模型組；c咖啡酸組，d百花九里明低劑量組；e百花九里明高劑組

a正常組；b模型組；c咖啡酸組，d百花九里明低劑量組；e百花九里明高劑組

表1 白花九里明提取物對(duì)不完全流產(chǎn)大鼠模型子宮組織tPA和PAI-1的影響（±，n=6）

表1 白花九里明提取物對(duì)不完全流產(chǎn)大鼠模型子宮組織tPA和PAI-1的影響（±，n=6）

平均光密度 IOD tPAPAI-1 空白組0.111±0.0230.076±0.018 模型組0.133±0.019#0.053±0.018 咖啡酸組0.107±0.006*0.092±0.024** 白花九里明低劑量組0.115±0.103*0.104±0.012**# 白花九里明高劑量組0.084±0.015**#0.102±0.017**

注：*＜0.05，**＜0.01與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01與空白組比較。

tPA組經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，＝0.092＞0.05，方差齊。使用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較，與正常組比較，模型組和和白花九里明低劑量組tPA水平均顯著增加，＜0.05。與模型組比較，咖啡酸組、白花九里明低劑量組、白花九里明高劑量組tPA水平顯著降低，＜0.05。白花九里明低劑量組和高劑量組之間比較，高劑量組較低劑量組tPA水平顯著降低，＜0.01。

PAI-1組經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，=0.056＞0.05，方差齊。與正常組比較，白花九里明低劑量組PAI-1水平均顯著增加，＜0.05。與模型組比較比較，咖啡酸組、白花九里明低劑量組、高劑量組PAI-1水平均顯著增加，＜0.05。

4 討論

纖溶系統(tǒng)，也叫纖維蛋白溶系統(tǒng)。主要功能是清除凝血物質(zhì)系統(tǒng)的必要產(chǎn)物。纖溶酶可血栓，在止血過程中發(fā)揮著很大功效。tPA一般由血管內(nèi)皮細(xì)胞形成，以極微量溶液濃度出現(xiàn)于血漿中。在血管內(nèi)，絲氨酸蛋白凝血酶將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)換成不溶性纖維蛋白，纖維蛋白原在纖溶的作用下溶解[6]，tPA還能夠使纖溶酶原轉(zhuǎn)換為纖溶酶，以實(shí)現(xiàn)催化毛細(xì)血管內(nèi)纖維蛋白降解的目的，而PAI-1主要是在血漿中以極微量的溶液含量出現(xiàn)，由包括毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌舒張細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌[7,8]。PAI-1通過抑制tPA和uPA而抑制纖溶酶形成，從而抑制纖溶。在正常生理狀態(tài)下，纖溶酶原激活劑和抑制劑維持動(dòng)態(tài)平衡，從而維持凝血和溶血的平衡。所以，目前臨床常采用測(cè)量組織型的纖維蛋白質(zhì)溶系統(tǒng)酶原活化物（tPA）和纖維蛋白質(zhì)溶解性酶原活化物控制纖因子（PAI-1）來說明纖維蛋白溶解系統(tǒng)[9]。

產(chǎn)后出血的主要包括因產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全、胎盤殘留、子宮內(nèi)膜炎等所致的產(chǎn)后出血以及流產(chǎn)所致的出血。其發(fā)生的原因主要有子宮收縮乏力、組織殘留、創(chuàng)傷以及凝血障礙，其中凝血功能障礙是導(dǎo)致產(chǎn)后出血的重要原因。這表明婦女在妊娠期凝血-纖溶的改變被認(rèn)為為引起產(chǎn)后出血的一個(gè)重要原因。梁榮偉等[10]研究表明纖溶酶的異常與產(chǎn)后出血量有關(guān)系。纖維蛋白過高或者過低都能引起產(chǎn)后出血。孫孟甜[11]等表明纖溶系統(tǒng)的異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)存在相關(guān)性。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為白花九里明具有散瘀止血、祛風(fēng)除濕的功能。常用于治療血瘀崩漏、溫痹痛、跌打腫痛等，在壯族民間常用水煎液進(jìn)行婦科止血。產(chǎn)后出血在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中又稱產(chǎn)后惡露不絕。其發(fā)病機(jī)理不論血瘀型、氣虛血瘀型、瘀熱互結(jié)型[12]均不外乎“瘀”。淤血阻滯沖任二脈，新血不得歸經(jīng)，從而使惡露過期不止。其治療手法也常以祛瘀為先，這同樣表明纖溶系統(tǒng)在止血過程中發(fā)揮的重要作用。因此，觀察產(chǎn)后出血纖溶系統(tǒng)的變化，可以反映體內(nèi)凝血系統(tǒng)的激活狀態(tài)，從而減少產(chǎn)后出血孕婦的死亡率。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不完全流產(chǎn)大鼠子宮出血后內(nèi)膜破損，細(xì)胞核皺縮、變小、甚至自溶，而白花九里明提取物可以促進(jìn)修復(fù)子宮內(nèi)膜，收縮平滑肌細(xì)胞，增加血管數(shù)量從而促進(jìn)產(chǎn)后子宮復(fù)舊，改善血流不止的情況。從纖溶系統(tǒng)來看，造模后tPA和PAI-1水平均有升高。而正常大鼠子宮中tPA和PAI-1含量很低。表明造模后，大鼠子宮出血，引起纖溶增加，而白花九里明提取物給藥干預(yù)后，tPA水平顯著下降，但PAI-1水平上升，這表明高劑量白花九里明可以降低纖溶系統(tǒng)的活性，提示白花九里明提取物可以通過調(diào)節(jié)不完全流產(chǎn)大鼠子宮中纖溶系統(tǒng)的活性，調(diào)節(jié)纖溶/抗纖溶的平衡，從而達(dá)到止血的目的。

[1] 方鼎，羅金裕，蘇廣洵，等. 壯族民間用藥選編[M]. 南寧: 廣西民族出版社，1985.

[2] 黃艷，寧小清，原鮮玲，等. 壯藥白花九里明水煎液止血作用機(jī)制探討[J]. 世界科學(xué)技術(shù): 中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2013，15(7): 1552-1556．

[3] 王杉，青桂玲，韋穎，等. 白花九里明提取液對(duì)小鼠出血時(shí)間、凝血時(shí)間和血小板數(shù)量的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué)，2012，33(9): 1228-1230.

[4] 那襲雪，寧小清，張文濤，等. 壯藥白花九里明提取物中咖啡酸含量測(cè)定及對(duì)子宮平滑肌作用[J]. 中藥藥理與臨床，2019，35(3): 71-74.

[5] 王曉東，趙軍寧，張白嘉，等. 藥物致早孕大鼠子宮出血模型的建立[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1999(2): 90-92.

[6] Ismail A A, Shaker B T, Bajou K. The plasminogen- activator plasmin system in physiological and pathophysiological angiogenesis[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 23(1): 337.

[7] Iwaki T, Urano T, Umemura K. PAI-1 progress in understanding the clinical problem and its aetiology[J]. British Journal of Haematology, 2012, 157: 291

[8] Patnaik M M, Moll S. Inherited antithrombin deficiency: A review[J]. Haemophilia, 14(6): 1229-1231.

[9] 徐勤. 西醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)概論[M]. 廣州: 中山大學(xué)出版社，2014.

[10] 梁榮偉，蘭枝，楊善業(yè)，等. 纖溶系統(tǒng)酶原檢測(cè)與產(chǎn)時(shí)出血量的相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)婦幼保健，2013，28(11): 1808-1810.

[11] 孫孟甜，裴依菲. 凝血-纖溶系統(tǒng)指標(biāo)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性分析[J]. 臨床心身疾病雜志，2022，28(1): 44-47，62.

[12] 蔡仁燕. 產(chǎn)后惡露不絕的中醫(yī)證治文獻(xiàn)研究[D]. 廣州: 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2011.

Effect of Zhuang Medicine(Randeria) Chang et Tseng Extract on Uterine Fibrinolytic System in Rats

Objective: To investigate the hemostatic mechanism of Zhuang medicineextract in fibrinolytic system by observing the pathological sections of rat uterus and detecting the expression of tPAand PAI-1 in uterine tissue. Methods: An incomplete uterine abortion model was established in healthy adult or non pregnant female mice, and then randomly divided into five groups, with ten mice in each group. The order was 6 group of low dosage of(Randeria) Chang et tseng extract, medium dosage of(Randeria) Chang et tseng, high dosage of(Randeria) Chang et tseng extract, blank, model and caffeic acid group. Uterine tissue was taken. The expression of tPA and PAI-1 in uterine tissue was determined by immunohistochemistry. Results: TPA was tested by homogeneity of variance,=0.092＞0.05, and the variance was homogeneous. One way variance was used for pairwise comparison. Compared with the normal group, the TPA levels of the model group and the low-dose group of(Randeria) Chang et tseng were significantly increased,＜0.05. Compared with the model group, tPA levels in caffeic acid group, low-dose group of(Randeria) Chang et tseng and high-dose group of(Randeria) Chang et tseng were significantly decreased,＜0.05. Compared with low-dose group and high-dose group of(Randeria) Chang et tseng, tPA level in high-dose group was significantly lower than that in low-dose group,＜0.01. PAI-1 group passed the homogeneity test of variance，=0.056＞0.05，and the variance was uniform. Compared with the normal group, PAI-1 levels in the low-dose group of(Randeria) Chang et tseng was increased significantly,＜0.05. Compared with the model group，PAI-1 levels in caffeic acid group，low-dose group and high-dose group of(Randeria) Chang et tseng increased significantly,＜0.05. Conclusion: The extract of(Randeria) Chang et tseng has the effect of promoting uterine hemostasis, and its mechanism may be related to the regulation of uterine fibrinolytic system.

Blumea megacephala (Randeria) Chang et Tseng; uterus; pathological section; tPA; PAI-1

R285

A

1008-1151(2022)10-0084-04

2022-08-15

廣西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)一般碩士研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YCSY20190026）。

楊宏（1996－），女，廣西中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及新產(chǎn)品開發(fā)。

寧小清（1966－），女，廣西中醫(yī)藥大學(xué)高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庤b定及質(zhì)量分析。