生姜中有效成分的粗提取及提取物抑菌活性研究

盧仲鋮，王 宇，張佳悅，史琦宏，張宏達(dá)

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪 117004)

生姜(Zingiber officinale Roscoe)是姜科姜屬植物的塊根莖，別名姜根、百云辣等，外表為不規(guī)則形狀，根莖肉質(zhì)肥厚，切片截面呈現(xiàn)淺黃色。生姜具有很高的藥用價(jià)值，其含有許多功能因子及生物活性成分，主要為揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷及黃酮類化合物[1]。在醫(yī)學(xué)上，生姜有增強(qiáng)腸胃、清熱解毒、促進(jìn)新陳代謝、改善心臟功能、降低血糖、保護(hù)膽肝、抗菌殺菌、增強(qiáng)免疫力、減少炎癥、抗氧化作用、抗過敏和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡等重要功能，其中生姜黃酮類有抗菌、抗炎、保護(hù)心血管、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功效。在食品、工業(yè)領(lǐng)域，姜油已經(jīng)變成高價(jià)值的貿(mào)易產(chǎn)品，對(duì)細(xì)菌、真菌有一定的抑制作用。姜辣素是生姜中辣味成分的總稱，使生姜具有獨(dú)特的風(fēng)味，其中主要活性成分為6-姜酚，可應(yīng)用于食品保鮮，化妝品護(hù)膚品祛痘消炎等方面，有很高的研究?jī)r(jià)值。

文章研究的目的在于探索生姜中幾種有效成分粗提物的抑菌性，為生姜的進(jìn)一步開發(fā)及綜合利用提供一定的借鑒。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為：從生姜中分別提取黃酮、姜油、姜辣素三種有效成分粗提物→設(shè)定不同濃度梯度的粗提液→對(duì)細(xì)菌、霉菌等常見菌種展開抑菌實(shí)驗(yàn)→分析抑菌性。

1 生姜樣品處理與抑菌實(shí)驗(yàn)菌種的選擇

1.1 生姜樣品處理

本實(shí)驗(yàn)所需樣品為生姜粉。將市面購得的新鮮生姜清洗干凈，切成小而薄的片狀，然后將生姜片放入烘箱中干燥，溫度調(diào)節(jié)為70 ℃，待重量恒定完全烘干，取出研磨粉碎、過篩處理后制得生姜粉(如圖1所示)。

圖1 新鮮生姜制成生姜粉

1.2 抑菌實(shí)驗(yàn)菌種的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用三種常見細(xì)菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸桿菌)和兩種常見霉菌為青霉菌、曲霉菌作為抑菌實(shí)驗(yàn)菌種，所用菌種均由遼寧科技學(xué)院藥化學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

2 生姜中三種有效成分的粗提取

2.1 生姜中黃酮類物質(zhì)的粗提取

采用超聲波輔助提取法，以濃度為90%的乙醇溶液為提取劑，料液比1∶20，取生姜粉5 g，量取100 mL 90%乙醇溶液，充分混合，放到超聲波清洗機(jī)中，設(shè)置溫度80 ℃，提取時(shí)間50 min，超聲波強(qiáng)度80 Hz的條件下提取兩次，得到生姜黃酮粗提液，將粗提液進(jìn)行真空抽濾，得到的濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮后蒸干得到的膏狀物質(zhì)即為生姜黃酮粗提物[2]，如圖2所示。

2.2 生姜中姜油的粗提取

采用索氏提取法，用石油醚(沸程30 ℃～60 ℃)為提取劑，連接索氏提取器裝置，稱取20 g生姜粉，用濾紙折疊出濾紙筒，將生姜粉放入濾紙筒中，防止生姜粉露出，將裝有生姜粉的濾紙筒放入浸提筒內(nèi)，在圓底燒瓶中加入200 mL石油醚溶液，恒溫水浴55 ℃，提取4 h。待提取完后將圓底燒瓶?jī)?nèi)提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮得到的油狀物質(zhì)即為姜油[3]，如圖3所示。

圖2 生姜黃酮粗提物

圖3 生姜姜油粗提物

2.3 生姜中姜辣素的粗提取

本實(shí)驗(yàn)用乙醇浸提法提取姜辣素，采用兩種方式：一是從生姜粉中提取姜辣素粗提物，稱取生姜粉5 g，量取350 mL無水乙醇與生姜粉充分混合，在70 ℃恒溫水浴鍋中浸提75 min，期間用玻璃棒不斷攪拌，使乙醇溶液和生姜粉充分接觸，浸提得到的粗提液進(jìn)行真空抽濾，得到的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，有晶體析出即為生姜姜辣素粗提物[4]；二是從新鮮生姜中提取姜辣素有效成分，稱取新鮮生姜150 g，研磨搗碎，量取450 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液放入研磨好的生姜中，恒溫水浴97 ℃，充分浸提1 h得到粗提液。過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮到有部分晶體析出后倒出，置于70 ℃恒溫水浴鍋上蒸干，得到姜辣素粗提物晶體[5]，如圖4所示。

圖4 生姜姜辣素粗提物

3 生姜中三種有效成分的抑菌效果

3.1 生姜中三種有效成分提取物的稀釋及無菌化處理

3.1.1 生姜中黃酮類物質(zhì)提取物稀釋及無菌化處理

對(duì)超聲波輔助提取法得到的生姜黃酮粗提物，用濃度為90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，按照10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的濃度配置樣品溶液，再用無菌注射器吸取并透過濾菌膜將其打入已滅菌的小試劑瓶中，然后在小試劑瓶上進(jìn)行濃度標(biāo)記。通過濾紙片法測(cè)定生姜黃酮粗提物在不同濃度下的抑菌活性，以濃度為90%的乙醇溶液為陰性對(duì)照，每種待測(cè)溶液對(duì)同一菌種做三個(gè)平行樣并觀察測(cè)量實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

3.1.2 生姜中姜油提取物稀釋及無菌化處理

對(duì)索氏提取法得到的生姜姜油粗提物，按照10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的濃度配置姜油丙酮溶液，配置時(shí)用玻璃棒攪拌使其充分溶解，再用無菌注射器吸取并透過濾菌膜將其打入已滅菌的小試劑瓶中，然后在小試劑瓶上進(jìn)行濃度標(biāo)記。通過濾紙片法測(cè)定生姜姜油粗提物在不同濃度下的抑菌活性，以丙酮溶液為陰性對(duì)照，每種待測(cè)溶液對(duì)同一菌種做三個(gè)平行樣并觀察測(cè)量實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的抑菌圈直徑[6]。

3.1.3 生姜中姜辣素提取物稀釋及無菌化處理

將用乙醇浸提法從生姜粉中提取的姜辣素粗提物，用無水乙醇進(jìn)行溶解，按照10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL的濃度配置樣品液，配置時(shí)用玻璃棒攪拌使其充分溶解，再用無菌注射器吸取并透過濾菌膜將其打入已滅菌的小試劑瓶中，然后在小試劑瓶上進(jìn)行濃度標(biāo)記。通過濾紙片法測(cè)定生姜粉中姜辣素粗提物在不同濃度下的抑菌活性，以無水乙醇溶液為陰性對(duì)照，每種待測(cè)溶液對(duì)同一菌種做三個(gè)平行樣并觀察測(cè)量實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的抑菌圈直徑。

3.2 抑菌圈直接的判定標(biāo)準(zhǔn)

本實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法測(cè)定各成分不同濃度粗提液的抑菌效果，具體操作流程為：制備培養(yǎng)基，涂布菌懸液→放置對(duì)照組及含各成分不同濃度粗提液的濾紙片于上一步的培養(yǎng)皿中→恒溫培養(yǎng)→測(cè)量抑菌圈直徑并做好數(shù)據(jù)記錄。

通常規(guī)定，抑菌圈直徑的判定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 抑菌圈直徑的判定標(biāo)準(zhǔn)

3.3 生姜中三種有效成分的抑菌效果

3.3.1 生姜中黃酮類粗提物的抑菌效果

生姜中黃酮類物質(zhì)粗提物對(duì)三種常見細(xì)菌的抑菌效果如表2所示。

表2 生姜黃酮粗提物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果

生姜中黃酮類物質(zhì)粗提物對(duì)兩種常見霉菌的抑菌效果如表3所示。

表3 生姜黃酮粗提物對(duì)霉菌的抑菌效果

根據(jù)表2、表3可知：生姜黃酮粗提物對(duì)五種供試菌種都產(chǎn)生一定的抑制效果，而作為陰性對(duì)照的90%乙醇溶液沒有抑菌作用。在細(xì)菌中，大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，結(jié)果表明：生姜黃酮既可以抑制細(xì)菌又可以抑制霉菌，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑菌效果。抑菌機(jī)理：黃酮物質(zhì)對(duì)菌類細(xì)胞壁具有破壞作用，生姜黃酮粗提物主要通過破壞菌類細(xì)胞壁，造成細(xì)胞內(nèi)容物泄漏來實(shí)現(xiàn)抑菌功效[7]。

3.3.2 生姜中姜油粗提物的抑菌效果

生姜中姜油粗提物對(duì)三種常見細(xì)菌的抑菌效果如表4所示。

表4 生姜姜油粗提物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果

生姜中姜油粗提物對(duì)兩種常見霉菌的抑菌效果如表5所示。

表5 生姜姜油粗提物對(duì)霉菌的抑菌效果

續(xù)表5

由表4、表5可知：生姜姜油粗提物對(duì)五種供試菌種均有抑制效果，則作為陰性對(duì)照的丙酮溶液沒有抑菌效果。由于大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，所以結(jié)果表明：生姜姜油既可以抑制細(xì)菌又可以抑制霉菌，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有抑制作用。經(jīng)分析，生姜姜油的抑菌機(jī)理應(yīng)與結(jié)構(gòu)相似的山茶油抑菌機(jī)理相同[8]，即其對(duì)菌類的細(xì)胞壁有破壞作用。

3.3.3 生姜中姜辣素粗提物的抑菌效果

生姜中姜辣素粗提物對(duì)三種常見細(xì)菌的抑菌效果如表6、表7所示。

表6 生姜(姜粉)姜辣素粗提物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果

表7 生姜(新鮮生姜)姜辣素粗提物對(duì)細(xì)菌的抑菌效果

生姜中姜辣素粗提物對(duì)兩種常見霉菌的抑菌效果如表8所示。

表8 生姜(姜粉和新鮮生姜)姜辣素粗提物對(duì)霉菌的抑菌效果

由表6～8可知：同樣品液濃度下，生姜粉中提取的姜辣素粗提物的抑菌效果要優(yōu)于新鮮生姜中提取的姜辣素粗提物，說明從生姜粉中提取姜辣素成分粗提物的含量，顯著多于從同質(zhì)量新鮮生姜中提取姜辣素成分粗提物的含量[9]，故前者抑菌效果更加明顯。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生姜中黃酮、姜油、姜辣素三種有效成分粗提物均具有一定的抑菌作用。生姜中黃酮類物質(zhì)既可以抑制細(xì)菌又可以抑制霉菌，對(duì)供試菌種抑菌效果順序?yàn)榭莶菅挎邨U菌>金黃色葡萄球菌>青霉菌>大腸桿菌>曲霉菌；生姜姜油提取物既可以抑制細(xì)菌又可以抑制霉菌，對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌效果相差不大，接近相同，生姜姜油粗提物對(duì)供試菌種抑菌效果順序?yàn)榇竽c桿菌=枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>青霉菌>曲霉菌；生姜姜辣素粗提物對(duì)供試細(xì)菌有抑菌能力，對(duì)供試霉菌沒有抑菌效果，對(duì)供試細(xì)菌的抑菌效果順序?yàn)榭莶菅挎邨U菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌。