植物凝集素的研究進展

韓紅艷，杜俊杰

(1.晉中學院，山西 榆次 030019；2.山西農(nóng)業(yè)大學，山西 太谷 030801)

凝集素的本質(zhì)是至少含有一個無催化活性域的蛋白或糖蛋白，能與特殊的單糖或寡聚糖結(jié)合，具有無酶活性或免疫活性，廣泛存在于從病毒到哺乳動物的各生物體中。研究發(fā)現(xiàn)在植物的不同組織和器官中大多數(shù)都含有凝集素，它們顯示著各自的結(jié)構(gòu)、功能和糖結(jié)合特異性，在細胞凝集、抑菌、抗病蟲害、抑制腫瘤等方面發(fā)揮重要的作用，同時在植物自身抵抗生物和非生物脅迫方面也發(fā)揮著重要的作用，因此對植物凝集素的研究是一項非常重要的工作。

1 植物凝集素研究起源

1888年，Stillmark從蓖麻籽中提取出一種能夠凝集人和其他動物血紅細胞的蛋白，從此開啟了植物凝集素的研究工作。隨后，Landsteine提出“本質(zhì)類似抗體”是植物凝集素的作用；1936年，Sumner和Howell提出凝集素具有糖結(jié)合專一性；Boyol和Renkonen確定凝集素具有凝集血細胞的專一性和特異性；隨后多數(shù)學者的研究證明大多數(shù)凝集素具有區(qū)分不同人類血型的特異性。Becker對伴刀豆凝集素(ConA)分子的三級結(jié)構(gòu)的分析，開啟了植物凝集素結(jié)構(gòu)和功能的研究，人類在植物凝集素的分類、提取、純化、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能和基因表達等方面的研究取得了很大進展。2017年，擬南芥凝集素結(jié)構(gòu)域完成了全基因組的篩選[1]；到目前為止已完成100多種植物凝集素全基因組測序，并證明了許多含有凝集素結(jié)構(gòu)域或與一種、多種其他類型的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白質(zhì)比只含有凝集素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)更為豐富，其在解讀生命的糖密碼中發(fā)揮著重要作用[2]；通過對個體基因、家族基因和功能基因組學研究的分析發(fā)現(xiàn)，凝集素與植物生長、發(fā)育、繁殖、防御和非生物脅迫耐受性息息相關(guān)。

2 植物凝集素的分類

凝集素是一組具有碳水化合物結(jié)合域(CRD)的結(jié)構(gòu)多樣的蛋白質(zhì)，它能可逆地結(jié)合特定的碳水化合物，其分為25個亞家族。[3]植物凝集素根據(jù)其CRD特性、結(jié)合糖的種類與結(jié)合糖的來源及氨基酸序列的同源性及其進化的相互關(guān)系可分為以下幾類(表1)：

表1 凝集素的分類

分類依據(jù)名稱物種序列相似性與進化親緣關(guān)系結(jié)合糖的來源賴氨酸基序Lysin motif賴氨酸基序的蛋白雪蓮花凝集素Galanthus nivalis agglutinin(GNA)雪蓮花非經(jīng)典凝集素non-classical lectin內(nèi)源碳水化合物經(jīng)典凝集素Classical lectin外源碳水化合物

3 植物凝集素的糖結(jié)合特性

植物凝集素廣泛存在于植物果實、種子等各組織和器官中，多數(shù)為具有高度糖結(jié)合特異性的糖蛋白，蛋白質(zhì)和糖綴合物之間可相互作用，一些特殊的氨基酸殘基對維持凝集素和糖的結(jié)合起著至關(guān)重要的作用。由于凝集素具有糖結(jié)合特性，已被廣泛應用于糖綴合物的純化，可區(qū)別正常和病變細胞，作為藥物包裹層以提高胃腸道系統(tǒng)對藥物的吸收能力，利用糖在細胞與細胞、細胞與胞外基、細胞與外界環(huán)境之間的信息傳遞中起到重要作用的功能，有利于研究凝集素參與有機體的信號轉(zhuǎn)導途徑的機制。

聚糖通過與蛋白質(zhì)和脂類的結(jié)合在真核細胞中發(fā)揮著重要作用。聚糖分為線性糖和多糖，多糖由重復的吡喃糖單糖環(huán)和支鏈糖組成，它們與凝集素非共價結(jié)合，而是通過參與各種生物學過程來控制生化反應，如：發(fā)育、凝血和對細菌、病毒感染的反應。傳統(tǒng)的檢測糖蛋白相互作用的方法有核磁共振波普、血凝抑制試驗、酶聯(lián)凝集素測定、表面等離子體共振、X-射線晶體學和等溫熱滴定等，這些方法雖然成功的闡明了聚糖和蛋白質(zhì)之間的相互作用，但需要大量的聚糖樣本?，F(xiàn)在人們利用高通量的技術(shù)來分析聚糖和蛋白質(zhì)之間的相互作用及其作用的分子基礎。通常細胞糖原的大小被認為在100 000～500 000個聚糖的范圍內(nèi)，這種大的糖基含量可歸因于寡糖鏈呈線性或支鏈形式的組合，單糖可通過其糖基中的各種碳原子連接。糖鏈的復雜性促使細胞編碼大量生物信息，而這些編碼所隱藏的信息對人類了解凝集素和聚糖之間相互作用的生物學特性是一個巨大的挑戰(zhàn)。

近年來，聚糖微陣列技術(shù)作為一種合適的科學方法被用來研究蛋白質(zhì)和聚糖之間的相互作用。通過功能糖組學微陣列(CFG)分析，為研究不同的凝集素和聚糖結(jié)合抑制劑提供了大量的聚糖微陣列數(shù)據(jù)，充分利用這些數(shù)據(jù)了解糖結(jié)合特異性需要一個系統(tǒng)的計算機方法協(xié)助，基序分離法和離群基序分析法(OMA)應運而生。目前基于計算機網(wǎng)絡的基礎，利用聚糖陣列數(shù)據(jù)研究蛋白與聚糖的相互作用將植物凝集素分為4類糖結(jié)合凝集素。

1)甘露糖結(jié)合凝集素。甘露糖結(jié)合凝集素又分為以下幾類：B-型凝集素超家族，這類凝集素在植物抵抗病蟲害和抑制病毒方面有特殊的作用，如雪蓮花凝集素家族的各成員均與HINI病毒具有很高的親和力[3]；氰菊酯-N(CV-N)凝集素，此凝集素能通過病毒表面覆蓋的糖蛋白gp120和gp41介導產(chǎn)生抗病毒活性。通過聚糖陣列分析，甘露糖特異性結(jié)合凝集素還包含有錦雞兒屬凝集素(CAA)、海芋屬凝集素(AMA)、秋水仙屬凝集素(LCA)和天南星屬凝集素(AHL)，目前對它們的糖結(jié)合特性鮮有報道。

2)半乳糖胺結(jié)合凝集素。這類凝集素又分為兩類：一類在細胞凝集活性中發(fā)揮著重要的作用，如曼陀羅凝集素(DSA)、蠶豆凝集素(SBA)、豬籠草凝集素(VVA)、紫荊凝集素(BPL)等；另一類屬豆科凝集素家族，如豆科刺桐屬凝集素(ECL)，已經(jīng)證明它具有凝集活性，對人類T淋巴細胞促有絲分裂。

3)巖藻糖結(jié)合凝集素。巖藻糖凝集素較為豐富，如荊豆凝集素(AAL)，具有5個巖藻糖結(jié)合位點，這類凝集素與促進細胞信號轉(zhuǎn)導有關(guān)。

4)Galb1-3半乳糖胺結(jié)合凝集素。這類凝集素富含N-?；咸擒蘸蚇-乙酰半乳糖嘧啶，如小麥胚芽凝集素(WGA)。

隨著糖生物學領(lǐng)域的發(fā)展，基于社區(qū)網(wǎng)絡分析，利用聚糖微陣列數(shù)據(jù)研究植物凝集素蛋白—聚糖相互作用，為不同植物組織和器官來源的凝集素的分類、純化和特性研究提供了更加科學有效的指導。

4 幾種典型植物凝集素的特點與應用

4.1 豆科凝集素

目前人類對植物凝集素家族中研究最多是豆類凝集素家族，它代表了凝集素中研究最徹底的家族，其具有多種生理功能和應用。如紅豆凝集素與黃芪多糖聯(lián)合應用能提高巨噬細胞吞噬活性、增強機體的免疫功能，并能提高脾臟指數(shù)；豆科凝集素通過與根瘤菌胞外多糖識別，并與根瘤菌表面的脂多糖、莢膜多糖交聯(lián)，將根周圍的根瘤菌聚集增加植物所需氮源[4]；豆科凝集素在種子萌發(fā)和成熟過程中起到保護、存貯和運輸?shù)墓δ?，具有促進有絲分裂[5]、抗真菌、抗病毒[6]、抗蟲和抑制腫瘤的作用[7]，例如將浙江苞蘿黃豆葉片中克隆的Leu4基因表達蛋白的菌液涂在小麥葉片上，小麥葉片長管蚜蟲數(shù)目減少50%[8]，其原因是菜豆凝集素對交格鏈孢菌具有抑制作用[9]；豆科凝集素可促進有絲分裂，如扁豆凝集素可促進胚胎的分裂和分化；豆科凝集素還可作為細胞保護因子維持和提高離體造血干細胞的存活[10]；大豆凝集素在抑制腫瘤方面也有重要的作用，如黑大豆凝集素可抑制乳腺癌和肝癌細胞的增殖[11]。

4.2 Jacalin類凝集素(Jacalin-related lectins，JRLs)

JRLs是植物凝集素超家族新成員之一，首次從木菠蘿果實的種子中分離出Jacalin蛋白[12]，到目前為止植物中至少有25種JRLs被明確，其中9種屬于包含有外源結(jié)構(gòu)域的嵌合凝集素，它們在植物的次生代謝中發(fā)揮著重要作用[13]，其余16種為小分子凝集素或全血細胞凝集素。根據(jù)JRLs糖基結(jié)合特異性可將其分為：甘露糖或葡萄糖特異的Jacalin凝集素(mannose-specific jacalin-related lectins，mJRLs)和半乳糖特異的jacalin凝集素(galactose-specific jacalin-related lectins，gJRLs)。

mJRLs在受到生物和非生物脅迫(病原體、干旱、鹽、強光、低溫等)刺激時誘導高豐度表達，這類蛋白多數(shù)定位于細胞質(zhì)和細胞核中，主要存在與葉、花和根等組織與器官中。JRLs與植物受環(huán)境脅迫和病原體攻擊密切相關(guān)，從基因水平分析，相當多的小麥JRLs基因存在應激誘導和組織特異性，JRL蛋白TaWC1是小麥獲得抗性反應的誘導基因表達產(chǎn)物[14]；甘露糖結(jié)合Jacalin TaHfr-1是褐飛虱幼蟲侵染小麥后被轉(zhuǎn)錄誘導；在防衛(wèi)信號分子水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)的刺激誘導下小麥甘露糖特異性結(jié)合JRLs樣基因豐度表達，SA和JA信號通路與植物防衛(wèi)反應相關(guān)，推測小麥JRLs參與了植物的防衛(wèi)反應；擬南芥抵抗真菌的侵染過程中TaJRLL1表達量上調(diào)[15]；大麥抵抗白粉病過程中TaJA1基因也得到了暫時性表達[16]；OsJAC1在真菌侵染時表達增強了對多種水稻病毒的抗性[17-18]。gJRLs表達基本不受生物和非生物脅迫刺激，gJRLs通過與外源糖類化合物結(jié)合提供防御病蟲害和植食性動物的傷害，gJRLs不僅通過結(jié)合靶生物體內(nèi)的糖基化合物殺滅病蟲害，同時通過改變相關(guān)基因的表達實現(xiàn)抗病蟲功能。gJRLs在植物營養(yǎng)貯藏器官種子和塊莖中高豐度表達，充當貯藏蛋白，并提供幼苗生長發(fā)育所需的N源。

JRLs不僅能識別碳水化合物增加植物的防御能力而且在植物的生長發(fā)育過程中也起著重要作用，參與植物自身細胞調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導行使內(nèi)源功能，具有非經(jīng)典凝集素的功能，因此成為今后凝集素研究的重點方向。

4.3 抗人體免疫缺陷病毒和抗流感病毒凝集素

凝集素存在于從病毒到哺乳動物的各種生命體中，可作為細胞間識別、細胞與社會環(huán)境、細胞與有機體之間的識別分子。從真核大藻類中提取出一種新的凝集素，可抗人體免疫缺陷病毒和抗流感病毒，有望成為一種新型的的抗病毒化合物[19]。該凝集素家族成員包括：OAA來自阿氏顫藻[20]，PFL來自熒光假單胞菌[21]，KAA-2來自長心卡帕藻[22]，BCA來自半球布氏藻[23]，ESA-2來自鋸齒麒麟菜[24]。它們共同的結(jié)構(gòu)特征是高甘露糖N-聚糖凝集素，有共同的高度保守序列組成2-4個串聯(lián)重復，可能與抗病毒活性相關(guān)。KAA-2是從可食用的栽培紅藻中提取的凝集素能抑制人類和海洋致病菌，預測該凝集素將會成為一種抑制病毒侵染的功能食品。

4.4 植物凝集素類受體蛋白激酶

凝集素類受體蛋白激酶(LecRLK)胞外凝集素結(jié)構(gòu)域無催化活性，根據(jù)胞外凝集素結(jié)構(gòu)域特性可將植物凝集素類受體蛋白激酶劃分為：G型、L型和C型3種類型。第1個鑒定出的凝集素類受體蛋白激酶基因ZmPK1，是從玉米中鑒定出的，參與調(diào)控花粉和柱頭的識別[25]。從煙草中鑒定的Nt-Sd-RLK基因受脂多糖誘導表達可提高植物的防御功能[26]；從楊樹中鑒定的PtLecRLK1凝集素類受體蛋白激酶參與植物與真菌的共生互作[27]；PSLecRLKs是豌豆中的一種定位于質(zhì)膜系統(tǒng)中的蛋白激酶，遇鹽脅迫上調(diào)[28]，對鹽脅迫有更強的耐受性，PSLecRLKs的表達減少了活性氧的積累，將細胞膜受到的損傷降低。Pnrlk-1南極苔蘚細胞質(zhì)型RLKs的同源物在鹽處理下增加對ABA的敏感性抑制了ROS的積累，減輕了鹽脅迫[29]。GsSRK(G-type lectin S-receptor-like serine/threonine protein kinase)通過同源克隆從大豆中分離得到，具有G-凝集素區(qū)，植物受到鹽脅迫、干旱脅迫和冷害等外界不良環(huán)境的刺激時GsSRK表達豐度提高，在抵抗不良環(huán)境反應中有重要作用[30-31]。

5 植物凝集素的發(fā)展前景

凝集素作為聚糖編碼信息的“讀者”，將聚糖作為信號開啟多種生理反應，通過聚糖-凝集素識別在細胞通訊中起重要作用[32]，凝集素作為探針應用于疾病的診斷和治療，同時在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也具有新型的應用價值。

5．1 作為抗腫瘤藥物

從海藻中分離并鑒定出許多甘露糖特異性凝集素具有殺滅病毒(被廣泛用作有效的HIV-1滅活蛋白)和抗癌特性(與癌細胞表面的高甘露糖N-聚糖識別與結(jié)合)；紫羅蘭凝集素誘導U87膠質(zhì)瘤細胞自噬[33]；番茄凝集素可提高MAGE1-HSP70/SEA復合蛋白納米乳劑疫苗的保護效果[34]；豆科植物凝集素抑制人乳腺癌細胞，人黑色素瘤細胞，人肝癌細胞HepG2[35]；木菠蘿凝集素抑制人宮頸癌細胞Hela；單子葉植物甘露糖結(jié)合凝集素抑制鼠纖維肉瘤細胞L929；從馬纓丹葉片提取的凝集素與人結(jié)腸癌HT29細胞有較強的結(jié)合力，并具有較強的抗真菌活性，誘導細胞凋亡[36]；從槲寄生屬植物中提取分離純化得到的凝集素—Ⅱ型核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[37]；黑木耳凝集素(LAA)不僅明顯抑制乳腺癌細胞MCF-7的增殖及遷移[38]，而且可以活化巨噬細胞RAW228.2，增強其核酸的合成和細胞的吞噬能力[39-40]。

5．2 為生殖醫(yī)學提供新型藥物

植物凝集素對生殖過程中包括受精胚胎著床，胚胎發(fā)育及妊娠過程等每一個環(huán)節(jié)都會產(chǎn)生影響，如白蕓豆凝集素處理孕鼠造成流產(chǎn)，及時終止不同時期的妊娠，長期給予小鼠陰道該藥物無副作用，但不同程度的凝集精子使其失活可進行避孕。期望能為研究新型的既能避孕又能預防包括HIV在內(nèi)的性傳播疾病的藥物，新型引產(chǎn)藥物，為生殖醫(yī)學提供依據(jù)。

5．3 作為新型的植物源殺蟲劑

植物凝集素可做為新型的植物源殺蟲劑用于作物的保護。將大蒜葉凝集素基因轉(zhuǎn)入煙草中，煙蚜的存活率下降80%。將國槐中凝集素基因SjLectin轉(zhuǎn)化到煙草中有效表達，其陽性植株對小菜蛾的抑制率平均62.2%[41]。植物凝集素對害蟲的殺蟲機制與其糖結(jié)合特性相關(guān)，通過基因工程和植物自身選育進化等多種方式開發(fā)，植物凝集素在防治害蟲方面有巨大的發(fā)展前景。

隨著凝集素純化技術(shù)的不斷完善，越來越多物種的凝集素將被純化出，通過不斷的實驗證明其功能和作用機制。目前人類從1 000多種植物中提取出凝集素，這對于整個植物界來說只是微乎其微，因此對凝集素的研究有待于進一步深入。