巴西蘇木素對骨關(guān)節(jié)炎模型中軟骨保護作用及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路變化的實驗研究

黃 滔，瓦慶德，何興川

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 骨科，貴州 遵義 563000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化、關(guān)節(jié)疼痛、滑膜炎為主要表現(xiàn)的慢性退行性疾病，是世界上最常見并致殘的疾病之一[1-2]。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細胞類型，其生物學(xué)變化與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的重要因素之一，過度的氧化應(yīng)激最終會導(dǎo)致軟骨細胞凋亡及分化，氧化應(yīng)激過程中過度的反應(yīng)性氧化物(Reactive oxidative species,ROS)積累將引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)，最終激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)途徑，誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡[4-5]，因此OA中軟骨細胞凋亡與ERS密切相關(guān)。

臨床中OA的治療以基礎(chǔ)治療配合藥物治療為首選方案，主要是改善患者的疼痛癥狀、抗炎等。如乙酰氨基酚、布洛芬等被作為OA疼痛的一線治療藥物，但這類藥物不能從根本解決軟骨損傷修復(fù)和炎癥問題，且長期用藥的毒副作用和耐藥也是不可避免的[6-7]。巴西蘇木素(Brazilin)是蘇木的主要活性成分，研究表明Brazilin具有軟骨保護和抗炎活性，是用于OA治療中一種很有前景的預(yù)防性藥物[8]，其中炎癥反應(yīng)的調(diào)控與ERS密切相關(guān)[9]。因此本研究探討的Brazilin是否通過ERS通路來參與OA中軟骨細胞損傷修復(fù)和炎癥的發(fā)生過程，具有重要的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 巴西蘇木素(純度≥98%)、膠原酶Ⅱ、CCK8試劑盒、甲苯胺藍染色液、0.25%胰蛋白酶、BCA法蛋白定量試劑盒均購自北京索萊寶公司；Recombinant Rat IL-1購自MCE公司；胎牛血清購自AusGene公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司；GRP78、CHOP、MMP13、β-actin抗體均購自ProteinTech公司；Collagen Type Ⅱ抗體購自杭州華安公司；qRT-PCR相關(guān)試劑購自TAKARA公司；引物購自上海生工公司；ECL發(fā)光劑購自Tanon公司。

1.2 儀器 低溫離心機(美國Thermo Fisher公司)；超聲破碎儀(寧波新芝)正置顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)；微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)、全波長酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；CFX96 實時熒光定量PCR儀、Supply Mini Protean 4電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、Chemi Doc成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗?zāi)Ｐ图胺纸M 分離培養(yǎng)SD大鼠出生第4d乳鼠軟骨細胞，分組如下：正常軟骨細胞組(Control組)，除Control組外，其余組均用IL-1β (10 ng/mL) 處理48 h建立OA體外模型，分為模型組(IL-1β組)、Brazilin低劑量組(2.5 μg/mL)、Brazilin中劑量組(5 μg /mL)、Brazilin高劑量組(10 μg /mL)。

1.4 原代軟骨細胞分離 取出生第4天的SD大鼠乳鼠，用75%酒精消毒，在體視顯微鏡下打開膝關(guān)節(jié)囊，并用含2%青鏈霉素混合液的無菌PBS沖洗3次，取出關(guān)節(jié)表面的軟骨組織，用無菌的膠原酶Ⅱ(1 mg/mL)消化液消化3 h，每隔0.5 h晃動1次，最后細胞消化液通過70 μm孔徑的細胞篩并接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.5 原代軟骨細胞鑒定 甲苯胺藍染色：將細胞爬片用PBS洗2次，晾干后在爬片上滴加200 μL甲苯胺藍染色液，染色5 min，ddH2O洗2次，晾干后中性樹脂封片，鏡下觀察。

1.6 CCK8檢測Brazilin對軟骨細胞增殖的影響 將軟骨細胞接種于96孔板，每孔1.5×105個細胞，培養(yǎng)48 h后用不同濃度的Brazilin進行處理，每組設(shè)5個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的OD值，得出細胞活力。

1.7 qRT-PCR檢測相關(guān)基因表達 收集處理后的細胞，每組加入1 mL Trizol重懸細胞進行裂解，室溫靜置5 min，加入200 μL 氯仿，充分混勻后室溫靜置5 min，4 ℃ 12 000 g 離心15 min，取上清轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入200 μL 異丙醇，室溫靜置5 min，4℃ 12 000 g 離心10 min，棄上清，每管用1 mL 75%酒精輕柔重懸沉淀，4℃ 12 000 g 離心10 min，棄上清，置于超凈工作臺中晾干后用ddH2O溶解，使用NanoDrop one微量分光光度計測定濃度，然后逆轉(zhuǎn)錄體系、擴增體系(引物序列如表1所示)按TAKARA公司說明書進行操作。每組樣本重復(fù)3次，本實驗應(yīng)用2-ΔΔCt法分析目標(biāo)基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 收集處理后的細胞，每組加入120 μL裂解液(RIPA裂解液：PMSR：蛋白酶抑制劑復(fù)合物=100∶1∶1)進行裂解，冰上靜置15 min，4℃ 12 000 g 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，BCA法蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，8%脫脂牛奶室溫封閉2 h，孵育一抗GRP78(1∶2 000)、CHOP(1∶1 000)、Collagen Type Ⅱ(1∶1 000)、MMP-13(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，孵育二抗Goat-anti Rabbit(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，滴加ECL顯影液并在凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，多組間差異比較采用單因素方差分析，進一步兩組比較方差齊選用LSD法，方差不齊選用Dunnett’T3法，P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細胞鑒定結(jié)果 蛋白聚糖是軟骨細胞分泌的機制成分，是軟骨細胞功能的主要指標(biāo)，因此可通過甲苯胺藍進行鑒定。結(jié)果顯示，軟骨細胞行甲苯胺藍染色后可見細胞核為藍色，細胞胞質(zhì)呈紫藍色異染反應(yīng)(見圖1A、B)，表明本實驗所采用的分離培養(yǎng)方法可獲得純度較高的原代軟骨細胞。

A:甲苯胺藍染色(×100)；B:甲苯胺藍染色(×200)。 圖1 軟骨細胞甲苯胺藍染色鑒定

2.2 Brazilin對軟骨細胞增殖的影響 結(jié)果顯示，不同濃度Brazilin處理軟骨細胞48 h后(n=5)，與對照組相比，Brazilin在低濃度可以促進軟骨細胞增殖，小于10 μg/mL的濃度對軟骨細胞的增殖均無影響，14 μg/mL開始對軟骨細胞增殖有顯著的抑制作用(P=0.041，見圖2)，且呈劑量依賴。因此后續(xù)實驗高、中、低劑量分別設(shè)為10、5、2.5 μg/mL。

* :與對照組比較，P<0.05；**：與對照組比較，P<0.01。圖2 不同濃度Brazilin處理對軟骨細胞增殖影響

2.3 Brazilin對IL-1β誘導(dǎo)的OA模型細胞形態(tài)觀察 相差顯微鏡觀察(n=3)，Control組軟骨細胞貼壁良好，呈多角形或梭形，折光度均一。IL-1β組可見較多細胞發(fā)生皺縮，變圓，折光度降低，并發(fā)生細胞脫落現(xiàn)象，Brazilin處理后可緩解這一現(xiàn)象，且呈劑量依賴(見圖3)。表明Brazilin可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA模型中軟骨細胞凋亡。

圖3 不同濃度Brazilin對OA細胞模型細胞形態(tài)的影響

2.4 Brazilin對軟骨細胞損傷修復(fù)及ERS標(biāo)志分子表達的影響 PCR結(jié)果顯示(n=3)，與對照組相比，模型組Collagen Type Ⅱ表達顯著下調(diào)(P<0.01)， Brazilin低劑量組與模型組無顯著性差異，中劑量、高劑量處理后可以顯著上調(diào)Collagen Type Ⅱ的表達(P<0.01，見圖4 A)；與對照組相比，模型組MMP-13表達顯著上調(diào)(P<0.01)，Brazilin低、中、高劑量處理后，可以下調(diào)MMP-13的表達(P<0.01)，見圖4 B。與對照組相比，模型組GRP78和CHOP表達顯著上調(diào)(P<0.01)，Brazilin低、中、高劑量處理后，GRP78進一步上調(diào)(P<0.01)，而CHOP表達顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖4 C和4 D。Western blot結(jié)果表現(xiàn)出了幾乎相同的趨勢(n=3，見圖5 A～E)。以上結(jié)果表明IL-1β誘導(dǎo)的OA細胞模型構(gòu)建成功，ERS途徑在OA模型被激活，Brazilin可以通過下調(diào)OA模型中MMP-13、CHOP的表達，上調(diào)Collagen Type Ⅱ、GRP78的表達，以達到軟骨保護作用。

A：各組細胞Collagen Type Ⅱ mRNA的表達變化；B：各組細胞MMP-13 mRNA的表達變化；C：各組細胞GRP78 mRNA的表達變化；D：各組細胞CHOP mRNA的表達變化；*、**:與對照組比較，P<0.05，P<0.01；#、##:與模型組比較，P<0.05，P<0.01。圖4 不同濃度BrazilinOA細胞模型中Collagen Type Ⅱ、MMP-13、GRP78、CHOP mRNA的表達

A～E：各組細胞Collagen Type Ⅱ、MMP-13、GRP78、CHOP蛋白的表達變化； *、** :與對照組比較，P<0.05，P<0.01；#、##:與模型組比較，P<0.05，P<0.01。圖5 不同濃度BrazilinOA細胞模型中Collagen Type Ⅱ、MMP-13、GRP78、CHOP蛋白的表達

3 討論

最新的《中國骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2021年版)》指出OA的治療應(yīng)以基礎(chǔ)治療(運動治療、物理治療等)配合藥物治療(鎮(zhèn)痛藥物、關(guān)節(jié)腔注射藥物等)為首選方案，但目前的藥物并不能從根本解決軟骨損傷修復(fù)問題，因此尋找能夠抑制軟骨炎癥、軟骨細胞凋亡、促進軟骨細胞損傷修復(fù)、再生的藥物具有重大的現(xiàn)實意義。天然藥用植物及其衍生產(chǎn)物，在治療慢性及疑難疾病方面具有獨特優(yōu)勢，目前天然藥用植物及其衍生物用于OA治療引起廣泛關(guān)注[10-12]。

OA發(fā)病的基本原理是由于關(guān)節(jié)軟骨合成代謝和分解代謝之間的平衡紊亂導(dǎo)致的。而金屬蛋白酶-13(MMP-13)構(gòu)成了分解代謝軸的重要作用。因此，MMP-13作為OA分子研究機制的重要調(diào)節(jié)因子引起人們極大的關(guān)注。大量研究表明，OA患者MMP-13水平顯著上調(diào)[13-15]，它是目前最有效的Ⅱ膠原蛋白酶(Collagen Type Ⅱ)降解酶[16]，能降解軟骨基質(zhì)中的Ⅱ型膠原，而Collagen Type Ⅱ降解破壞是OA中軟骨功能減退的主要原因之一，因此該過程是OA發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵事件。本研究在采用IL-1β誘導(dǎo)軟骨細胞構(gòu)建OA細胞模型中，檢測到MMP-13的表達上調(diào)、Collagen Type Ⅱ表達下調(diào)、細胞發(fā)生凋亡，表明構(gòu)建的OA細胞模型能夠有效模擬OA患者的軟骨損傷狀態(tài)。

蘇木具有活血祛瘀、消腫止痛的功效，常用于治療跌打損傷、骨折筋傷、瘀滯腫痛等癥，巴西蘇木素(Brazilin)作為蘇木的主要活性成分，已被報道具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、對紫外輻射引起的細胞損傷起保護作用等活性[17-19]。且有研究表明，Brazilin可以抑制TNF-a、IL-1β的釋放實現(xiàn)抗炎的功能[20]。而在OA患者的滑液、滑膜和軟骨中發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1和IL-6水平異常升高，因此Brazilin對OA的治療具有極大的研究意義[21-22]。本研究得到Brazilin不影響軟骨細胞增殖下的臨界濃度，為體內(nèi)用藥提供實驗依據(jù)，并通過細胞形態(tài)學(xué)觀察到Brazilin可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的OA細胞模型中軟骨細胞凋亡，且有效逆轉(zhuǎn)MMP-13和Collagen Type Ⅱ的表達，表明Brazilin對于OA軟骨的損傷具有一定修復(fù)作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是由于環(huán)境因素(如ROS、未正確折疊蛋白累積、鈣離子平衡紊亂等)造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動態(tài)平衡失調(diào)，引發(fā)的一種亞細胞器應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，OA中軟骨細胞凋亡與ERS密切相關(guān)[4-5]，且Brazilin的抗炎活性與ERS密切相關(guān)[9]。ERS 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程程主要由葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78( Glucose regulated protein 78kD,GRP78)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，參與蛋白質(zhì)的糖基化修飾、折疊和轉(zhuǎn)運[23]。非ERS狀態(tài)時，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種跨膜蛋白相結(jié)合，即蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase R like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子(Activating transcription factor 6,ATF6)及肌醇需求酶 1(inositol requiring enzyme-1,IRE1)；ERS狀態(tài)時，GRP78與3種蛋白分離，發(fā)生構(gòu)象改變，進而使3種跨膜蛋白發(fā)生磷酸化并激活下游信號通路[24]。輕度ERS時，GRP78表達迅速增加引導(dǎo)蛋白質(zhì)進行重新折疊等，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，以減輕這些損傷，促進細胞的存活；過度ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失代償，GRP78表達降低，同時啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡程序。C/EBP-homologous protein(CHOP)是ERS特異的促凋亡因子，是由GRP78啟動凋亡程序中的標(biāo)志分子之一，其轉(zhuǎn)錄上調(diào)是ERS中啟動凋亡程序的主要途徑，最終導(dǎo)致細胞不可逆的損傷并凋亡[25]。在本研究中，IL-1β誘導(dǎo)的OA模型中軟骨細胞發(fā)生過度的ERS，導(dǎo)致GRP78顯著下調(diào)以及CHOP的顯著上調(diào)，從而誘導(dǎo)軟骨細胞的損傷。Brazilin處理后有效逆轉(zhuǎn)GRP78和CHOP的表達，表明Brazilin可能通過ERS途徑抑制OA中軟骨細胞的損傷。

綜上所述，IL-1β能夠有效誘導(dǎo)軟骨細胞損傷從而構(gòu)建OA細胞模型，并能通過激活ERS通路促進軟骨細胞凋亡，Brazilin通過抑制該途徑實現(xiàn)軟骨保護作用，為Brazilin在軟骨細胞損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供了新思路。