芪風(fēng)固表顆粒對肺炎鏈球菌感染小鼠肺組織Toll樣受體4/核因子-κBp65信號(hào)通路的影響

王 欣，郭雨瑩，蒙艷麗，劉 洋，王 萍，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

芪風(fēng)固表顆粒是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院自主研發(fā)的中成藥(國藥準(zhǔn)字B20020410)，由黃芪、刺五加、白術(shù)、五味子、防風(fēng)、麥冬6味中藥組成，具有益氣固表、健脾補(bǔ)肺益腎的功效，用于肺、脾、腎虛弱所致的慢性咳嗽緩解期的輔助治療。該品種組方及制備工藝已獲得國家發(fā)明專利(專利號(hào)：ZL 2004 1 0098805.0)，且為獨(dú)家品種，被收載于2020年版《中國藥典》[1]。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)是引發(fā)肺部炎癥的重要病原菌[2]，并可引起慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺氣腫等疾病的急性發(fā)作。本研究以Spn感染引發(fā)的炎癥作為切入點(diǎn)，選擇炎癥反應(yīng)的經(jīng)典Toll樣受體4/核因子κB因子(TLR4/NF-κB)信號(hào)通路，觀察芪風(fēng)固表顆粒對肺鏈球菌感染的預(yù)防效果，并為新藥大品種的二次開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 芪風(fēng)固表顆粒：黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供，批號(hào)：20191209。泛福舒(細(xì)菌溶解產(chǎn)物膠囊，Bacterial Lysates)：瑞士OM Pharma SA公司，批號(hào)：1800273。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡BALC/B小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼用，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，合格證號(hào)SCXK(黑)2019-001，小鼠于25℃、濕度60 % GLP實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 肺炎鏈球菌(菌種編號(hào)10913)：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；Rabbit Anti-NF-κBp65 antibody：北京萬類生物科技有限公司，批號(hào)：L06091273；Rabbit Anti-TLR4 antibody：美國Abcam公司，批號(hào)：GR324006-1；兔超敏免疫組化試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2125B0225；Real-Time PCR試劑盒：美國Promega公司，批號(hào)：0000383124。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 RM2235組織切片機(jī)：德國萊卡；S40-Slider 顯微鏡：德國萊卡；BX4-1生物顯微鏡：日本OLYMPUS；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀：瑞士Tecan；9600熒光定量PCR儀：杭州博日有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肺炎鏈球菌的培養(yǎng) 將肺炎鏈球菌(Spn)菌種凍干粉用無菌生理鹽水溶解后接種于血平板上，培養(yǎng)18～20 h，挑取單個(gè)菌落3 區(qū)劃線法傳代，傳至第3代后，接種于液體THY培養(yǎng)基(500 mLTHB培養(yǎng)基+0.5%酵母提取物+多粘菌素5 mg+萘啶酮酸7.5 mg)內(nèi)，并在37℃下培養(yǎng)18～20 h。

2.2 動(dòng)物分組、造模及給藥 60 只小鼠隨機(jī)分為芪風(fēng)固表顆粒高劑量組(2.6 g/kg)、芪風(fēng)固表顆粒中劑量組(1.3 g/kg)、芪風(fēng)固表顆粒低劑量組(0.65 g/kg)、泛福舒組(0.63 mg/kg)、模型組和正常對照組，每組10 只；各組小鼠每天給藥1次，預(yù)防給藥40 d；模型組和正常組給予等量生理鹽水。給藥40 d后，除正常組外，各組小鼠滴鼻感染7.66×1014CFU/mL肺炎鏈球菌50 μL 1次，感染48 h后處死小鼠，取肺組織。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 HE染色觀察肺組織病理變化 取小鼠左肺，放置于組織包埋盒中，10 %甲醛固定后，石蠟包埋，制成4μm切片，蘇木素、伊紅染色后封片，顯微鏡下觀察肺組織損傷和炎癥情況。

2.3.2 RT-PCR檢測肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA表達(dá) 取新鮮肺組織50 mg，1 mLTrizol提取肺組織RNA，加氯仿、異丙醇、冰凍乙醇等試劑，離心后，DEPC水溶解提取RNA。酶標(biāo)儀檢測RNA純度及濃度后，根據(jù)RT-PCR試劑盒進(jìn)行操作。引物序列見表1。

表1 引物序列

反應(yīng)條件：37 ℃，15 min，95 ℃，10 min，95 ℃預(yù)變性10 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

2.3.3 免疫組化法檢測肺組織NF-κBP65、TLR4蛋白表達(dá) 肺組織放入10%甲醛內(nèi)固定，脫水、包埋、切片，切片在65 ℃烘箱內(nèi)加熱1.5 h后，依次進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度酒精洗脫二甲苯后。pH6的檸檬酸緩沖液高壓抗原修復(fù)后滴加H2O2。一抗過夜，滴加反應(yīng)增強(qiáng)液20 min，后滴加二抗，DAB顯色，蘇木復(fù)染，封片后顯微鏡下觀察，進(jìn)行IHC 評分。每張切片選取3個(gè)視野，以著色深淺程度及其面積計(jì)分，淺黃色為弱陽性計(jì)1分，棕黃色為中等陽性計(jì)2分，褐色為強(qiáng)陽性計(jì)3分；著色細(xì)胞面積數(shù)在25%以下計(jì)1分，在25%～49% 計(jì)2分，在50%以上計(jì)3 分。最終以兩者乘積為綜合積分統(tǒng)計(jì)[4]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用 SPSS 26.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析方法分析各組間差異，P<0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠肺組織病理變化 HE染色顯示：正常組小鼠無病理改變出現(xiàn)。模型組小鼠支氣管有輕度的上皮水腫，少量的炎細(xì)胞浸潤，整體支氣管病變較輕；肺泡及泡壁間質(zhì)血管病變較重，以中重度病變?yōu)橹?；肺泡壁無明顯破壞，肺泡上皮細(xì)胞變性，組織滲出，血管充血，大量中性粒細(xì)胞浸潤，病變以片狀或彌漫出現(xiàn)。各給藥組支氣管病變發(fā)生率低于模型對照組，均出現(xiàn)不同程度肺泡及泡壁間質(zhì)血管病變，病變程度與模型組比較有所減輕。芪風(fēng)高劑量組小鼠支氣管無病變；肺泡及泡壁間質(zhì)血管病變以正常、輕、中度病變?yōu)橹?；芪風(fēng)中劑量組支氣管以輕度病變?yōu)橹?；肺泡及泡壁間質(zhì)血管病變以輕、中度病變?yōu)橹?；泛福舒組肺組織整體病變程度較輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE，×20)

3.2 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果 見表2。

表2 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA表達(dá)的比較

3.3 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4蛋白表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果 見圖2，表3。

表3 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4 蛋白表達(dá)IHC評分比較

圖2 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4蛋白表達(dá)的免疫組化檢測結(jié)果(×20)

4 討論

芪風(fēng)固表顆粒是由傳統(tǒng)經(jīng)方“玉屏風(fēng)散”與“生脈飲”合方化裁所得，用黑龍江道地藥材刺五加代替人參，減緩原方燥性，增強(qiáng)滋潤之功，肺、脾、腎三臟同調(diào)。方中黃芪味甘，性微溫，歸脾、肺經(jīng)，內(nèi)可大補(bǔ)肺脾之氣，外可固表止汗，能補(bǔ)三焦而實(shí)衛(wèi)氣為君藥；刺五加性溫，味辛、微苦，益氣健脾，補(bǔ)腎安神，與黃芪相配既增強(qiáng)益氣之功，又增加補(bǔ)腎之效力，白術(shù)健脾胃、溫分肉，培土以寧風(fēng)，防風(fēng)遍行周身，走表而散風(fēng)邪，治風(fēng)獨(dú)取此味，任重功專，三藥相合祛邪而不傷正，補(bǔ)中寓疏，散中寓補(bǔ)，共同為臣藥；麥冬味甘性寒，具有養(yǎng)陰清熱、潤肺生津的功效，與刺五加相配，更增益氣養(yǎng)陰生津之功，五味子味酸性溫，能斂肺止汗，生津止渴，兩藥合用，潤、斂結(jié)合，養(yǎng)陰、生津、斂陰，共為佐藥。全方外有防衛(wèi)，內(nèi)有溫養(yǎng)，共奏益氣固表、健脾補(bǔ)肺益腎之功。

Toll樣受體4(Toll like receptors 4，TLR4)是一種細(xì)胞膜表面受體，屬于I型跨膜蛋白，表達(dá)于肺泡內(nèi)皮及上皮細(xì)胞等處。通過識(shí)別胞外細(xì)菌、病毒抗原、細(xì)胞因子等，將細(xì)胞外刺激向胞內(nèi)傳遞，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)識(shí)別促炎信號(hào)，招募下游銜接蛋白從而激活NF-κB，使NF-κB由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，合成促炎因子，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，參與多種疾病進(jìn)程[5-6]。

核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，為炎癥反應(yīng)的核心調(diào)控因子，被稱為早期基因表達(dá)的開關(guān)，常見的形式為p65/p50或p65/p65。NF-κB主要存在于細(xì)胞漿內(nèi)，參與體內(nèi)細(xì)胞的增殖、感染和炎癥免疫反應(yīng)等[7-8]。NF-κB的活化可介導(dǎo)白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子ɑ等炎性介質(zhì)的表達(dá)，引起炎癥介質(zhì)的合成及釋放。

研究發(fā)現(xiàn)TLRs/NF-κB信號(hào)通路在肺炎鏈球菌引發(fā)的炎癥中具有重要作用。在Spn感染過程中，Spn可引起 NF-κB 通路的激活，增強(qiáng) NF-κB p65的表達(dá)水平[9]；同時(shí)，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)處理后的肺泡上皮細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平升高[10]。

本次實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠肺組織TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01)，而預(yù)防給藥的芪風(fēng)固表顆粒組小鼠肺組織病理炎癥有所減輕，TLR4和NF-κBp65 mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.05)；說明芪風(fēng)固表顆粒具有減輕Spn引起的肺組織炎癥的作用，機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，芪風(fēng)固表顆?？赡芡ㄟ^抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制肺炎鏈球菌引發(fā)的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮對肺組織的保護(hù)作用。