紫菀水提液對肺炎支原體感染小鼠肺組織病理變化、細胞凋亡及TGF-β1表達的影響

王曉溪，徐慧星，王 博，王 欣，李 強，蒙艷麗，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是由肺炎支原體(Mycoplsma pneumoniae, MP)引起的以肺間質病變?yōu)橹鞯募毙苑尾垦装Y。轉化生長因子TGF-β1是目前研究最為廣泛的轉化生長因子之一，具有較多的生物學功能，包括激發(fā)炎癥反應、細胞生長分化、組織修復、免疫調節(jié)等[1]。肺炎支原體感染可導致TGF-β1高表達，與氣道炎癥和膠原蛋白在氣道的沉積關系密切，且與肺炎支原體嚴重程度相關[2]。目前，臨床上主要使用大環(huán)內酯類抗生素治療MPP，不良反應大、副作用強，耐藥率高[3-4]。因此，開發(fā)能夠治療MPP的中藥研究顯得尤為重要。

紫菀是治療呼吸系統(tǒng)疾病常用藥，具有止咳化痰功效。據(jù)《本草綱目》記載，其花、根均可入藥，味辛、苦，性溫，歸肺經(jīng)。據(jù)《神農本草經(jīng)》中記載，其主咳逆上氣，胸中寒熱結氣，去蠱毒痿蹶，安五臟。《名醫(yī)別錄》中也記載其“療咳唾膿血，止喘悸，五勞體虛，補不足，小兒驚癇”。紫菀具有潤肺下氣、消痰止咳的作用。在臨床上，紫菀頻現(xiàn)于治療支氣管肺炎、小兒肺炎、咳嗽等方劑中[5]。有研究表明，紫菀具有抗MP的作用[6]，但其作用機制仍不明確。

本研究預通過觀察紫菀水提液對肺炎支原體感染小鼠肺組織病理變化、細胞凋亡及肺組織中子TGF-β1表達的調控作用，探討紫菀治療肺炎支原體肺炎的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 紫菀藥材購自于哈爾濱市同仁堂，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學院王偉明研究員鑒定屬菊科植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根及根莖。紫菀水提液的制備：稱取紫菀211.5 g，浸泡30 min，加水煎煮2 次，每次1.5 h，過濾后合并濾液。在60 ℃恒溫條件下，濃縮至相對密度為1.35的浸膏，備用。阿奇霉素：石藥集團歐意藥業(yè)有限公司，批號：274180404。

1.2 實驗動物 60 只C57小鼠，SPF級，雌雄各半，6周齡，體質量(20±2)g，于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部購買，生產許可證號：SCXK(黑)2009-001。小鼠飼養(yǎng)于GLP實驗室內。

1.3 實驗試劑 PPLO：美國BD公司，批號：7110677；胎牛血清：美國Hyclone公司，貨號：SH30070.03；RNA提取試劑盒：中國Tiangen公司，貨號：DP419；Real-time PCR試劑盒：美國Promega公司，貨號：A6020；PBS緩沖液：中國Solarbio公司，批號：P1010；細胞凋亡檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所，貨號：G004-1；TGF-β1引物：上海生物工程技術有限公司設計合成。

1.4 實驗儀器 M200多功能酶標儀：奧地利TECAN公司； FACSCalibur流式細胞儀：美國BD公司；MYSPIN-12迷你離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司； ST-16R型低溫高速離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司；Line Gene 9600 Real-Time PCR儀：中國杭州博日科技有限公司；BX41熒光顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.5 肺炎支原體培養(yǎng) 肺炎支原體(ATCC 15531)：美國American Type Culture Collection。于無菌操作臺配制肺炎支原體培養(yǎng)基，已滅活的PPLO基礎培養(yǎng)基140 mL，0.5 mL青霉素溶液，4 mL 50%葡萄糖注射液，20 mL酵母浸液，已滅活胎牛血清40 mL，均用微孔濾膜除菌后混合，4 ℃保存?zhèn)溆?。肺炎支原體的傳代培養(yǎng)方法參照楊志敏等[7]的實驗方法。以1∶9的比例傳代菌液，待菌液顏色由紅色變?yōu)辄S色時，表明MP培養(yǎng)結果陽性，方可進行小鼠滴鼻造模。

1.6 小鼠分組、造模及給藥 將C57小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、 模型對照組、 陽性對照組和紫菀高、中、低劑量組。除正常組外，其余各組小鼠采用滴鼻法感染造模。予 20 μL (1×106CCU)肺炎支原體滴鼻，連續(xù)3 d。造模成功后，紫菀各劑量組給予紫菀水提液0.49、 0.98、 1.95 g/kg 灌胃，陽性組予阿奇霉素32 mg/kg灌胃，每日1 次，連續(xù)給藥 14 d； 正常對照組及模型對照組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。

1.7 觀察指標

1.7.1 肺組織病理學觀察 末次給藥后禁食水12 h，戊巴比妥麻醉小鼠，脫頸椎處死，取肺組織，生理鹽水清洗后，置于10 %甲醛溶液中浸泡，24 h后，進行石蠟包埋、切片，將組織切片浸泡于二甲苯溶液中，再浸泡于不同濃度乙醇溶液中，依次進行蘇木素和伊紅染色，顯微鏡觀察病理情況改變。

1.7.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取各組小鼠新鮮肺組織50 mg置于無菌1.5 mL離心管中，手術剪刀剪碎后，加入1 mL PBS緩沖液，放入全自動4 ℃低溫研磨機，充分研磨2 min，1 000 r/min 常溫離心3 min，離心半徑8 cm，去上清，再次加入1 mL PBS緩沖液輕輕重懸，過細胞篩，1 000 r/min常溫離心3 min，棄上清，每組加入500μL細胞凋亡結合液后，待用。正常對照組分為4管，1管不做處理；2管加入5 μL Annexin V混勻后，室溫避光孵育10 min；3管加入5 μL PI混勻后，室溫避光孵育10 min；4管分別加入5 μL Annexin V、5 μL PI混勻后，室溫避光孵育10 min；模型對照組、紫菀各劑量組及陽性組均與正常組第4 管處理方式相同。正常組1、2、3管用于調試機器參數(shù)，第4管用于正式上樣，所有樣本處理完畢后，上機檢測。

1.7.3 Real-time PCR檢測TGF-β1 mRNA表達 取各組小鼠肺組織剪碎后，加入Trizol試劑，用于的RNA提取。酶標儀檢測各組RNA的濃度，將各組樣品的RNA濃度稀釋至100 mg/L。按照一步法 Real-time PCR試劑盒實驗操作步驟檢測目的基因TGF-β1 mRNA表達水平。引物基因序列如下：TGF-β1-forward primers 5′-GCT GAG CGC TTT TCT GAT CCT-3′，reverse primer 5′-CGA GTG TGC TGC AGG TAG ACA-3′。采用2-ΔΔCt分析方法，計算TGF-β1的mRNA表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行分析，應用單因素方差分析方法分析各組間差異，相關數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理觀察結果 各組小鼠肺組織HE染色結果見圖1。正常對照組小鼠肺組織細胞形態(tài)完好，無病理改變。模型對照組小鼠肺組織可見支氣管間隙變窄，肺泡腔呈現(xiàn)不規(guī)則排列，肺血管內充血，肺組織有炎癥變化。各給藥組小鼠肺組織病理形態(tài)變化并不明顯，僅存在炎癥細胞浸潤情況。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE，×200)

2.2 各組小鼠肺組織細胞凋亡檢測結果 流式細胞凋亡圖四象限的左下(LL)區(qū)表示正常細胞數(shù)量，以早期凋亡(LR)、晚期凋亡(UR)及凋亡細胞(UL)總和在細胞總數(shù)中占百分比表示細胞的凋亡率，見圖2，表1。通過流式細胞凋亡實驗結果可以看出，與模型對照組比較，給藥組小鼠肺組織細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組小鼠肺組織單細胞懸液流式細胞凋亡實驗結果

表1 各組小鼠肺組織細胞凋亡率比較

2.3 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達的RT-PCR檢測結果 見表2。

表2 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達的比較

3 討論

MPP的發(fā)病機制有3 種，一種是MP直接侵犯呼吸道，二是MP能夠緊密結合在呼吸道上皮細胞上，三是免疫反應誘導的間接免疫致病理損傷[8]。在肺炎支原體肺炎發(fā)病進程中，TGF-β1是執(zhí)行免疫抑制的重要細胞因子[9]，具有調控細胞生長和抑制初始T細胞分化、凋亡、遷移以及細胞黏附、調節(jié)細胞外基質基因表達、調節(jié)免疫穩(wěn)定的作用 [10-11]。并且，在誘導肺泡上皮-間充質轉化、介導細胞外基質沉積等方面具有極其重要的作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)紫菀水提液通過降低TGF-β1的表達，在調控細胞凋亡、調節(jié)細胞免疫等方面上發(fā)揮作用。

紫菀含有的化學成分種類多，其中含有的活性成分也比較多。除具有鎮(zhèn)咳祛痰功效外，紫菀還具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、通便利尿等多種作用[13]。目前對其藥效學、藥理學研究尚不完善。本研究通過觀察結果顯示：紫菀水提液可修復感染MP小鼠肺組織的病理損傷、抑制小鼠肺組織細胞的凋亡以及降低小鼠肺組織TGF-β1 mRNA的表達；說明紫菀能夠減輕MP造成的肺損傷，抑制MPP病理進程。一方面，紫菀發(fā)揮其對MP的抑制作用，另一方面發(fā)揮其抗炎的作用。此研究為治療肺炎支原體肺炎的中藥新藥研發(fā)及臨床研究奠定了一定的基礎，并為紫菀藥材的開發(fā)利用提供依據(jù)。