基于AMPK信號通路探討蟲草素對過氧化氫致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

孫澤帆，王海波，翟昌林

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院·浙江 杭州 310053)

心血管疾病是危害人類健康的主要疾病之一，據(jù)報道，由于不合理飲食、缺乏運(yùn)動、吸煙飲酒等危險因素的廣泛流行，心血管疾病的病死率及發(fā)病率在未來5年會依然呈增長趨勢，占總死亡率的40%[1]。蛹蟲草作為一種名貴藥材，其性平味甘，入肺腎二經(jīng)，具有“益肺腎、止血化痰”等功效，在中醫(yī)學(xué)被廣泛應(yīng)用。除此之外，有報道稱，蛹蟲草具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老及增強(qiáng)免疫力等作用，我國基于其生物功效研制的白血病新藥也已進(jìn)入I期臨床階段[2]。蟲草素作為蛹蟲草的主要活性物質(zhì)，具有更加廣泛的藥理活性，包括抗炎癥、抗氧化和抑制細(xì)胞分化等心血管保護(hù)作用[3-6]。既往研究表明，心肌細(xì)胞損傷或凋亡是導(dǎo)致各類心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[7]，雙氧水作用于心肌細(xì)胞會產(chǎn)生大量的活性氧，是經(jīng)典的致心肌細(xì)胞氧化損傷的模型構(gòu)建方式[8]，但國內(nèi)外鮮有報道蟲草素在該過程中的作用。基于上述背景，本研究觀察了蟲草素對于雙氧水致心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用并探討與AMPK信號通路的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 蟲草素：江蘇Unisyn Biotech公司，貨號：Y120220215A。H9C2心肌細(xì)胞：上海中喬新舟生物科技公司。低糖DMEM培養(yǎng)基：Hyclone公司；胎牛血清：Gibco公司；CCK8試劑盒：Elabscience公司；ROS試劑盒：南京建成公司；Western抗體：Affinity公司，AMPK(貨號：AF6423)、p-AMPK(貨號：AF3423)、β-actin(貨號：AF7018)。H2O2：環(huán)凱微生物。ELX800酶標(biāo)儀：BIOTEK公司；LSR Fortessa流式細(xì)胞儀：美國BD；TZD-CL-200S顯影儀：廈門天中達(dá)生物科技；CKX41顯微鏡：奧林巴斯。

1.2 蟲草素溶液的配制 使用分析天平稱取蟲草素1.01 mg，加入200 μL DMSO溶液，完全溶解后加入9.8 mL完全培養(yǎng)基(90%低糖DMEM培養(yǎng)基+10%FBS)，使用0.22 μm孔徑的過濾器過濾除菌，母液濃度為400 μmol/L，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，選擇加入細(xì)胞中的終濃度為10 μmol/L。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，使用低糖DMEM培養(yǎng)基添加10%的FBS，細(xì)胞生長至80%予以傳代。

1.4 細(xì)胞分組及處理 H9C2心肌細(xì)胞傳代鋪板后分為3組，分別為：正常組(Control)：正常培養(yǎng)，正常同步換液處理；氧化損傷組(ODG)：待實驗細(xì)胞生長密度達(dá)到70%時，加入H2O2,濃度設(shè)定為600 μmol/L，持續(xù)作用12 h。蟲草素組(Cordycepin)：在構(gòu)建氧化損傷模型前，加入蟲草素10 μmol/L，持續(xù)作用12 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 CCK8實驗檢測H9C2心肌細(xì)胞活力 (1)消化對數(shù)生長期的H9C2心肌細(xì)胞，鋪96孔板，每孔鋪6 000個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h；(2)3組細(xì)胞分別處理：其中正常組予以換液處理，ODG組構(gòu)建氧化損傷模型，蟲草素組使用蟲草素10 μmol/L預(yù)處理12 h后構(gòu)建氧化損傷模型；(3)向每孔加入10 μL CCK8溶液，37 ℃孵育1 h；(4)使用酶標(biāo)儀設(shè)定450 nm檢測波長，測定各組吸光度值；(5)計算細(xì)胞活力值，細(xì)胞活力值=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(Control組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測H9C2心肌細(xì)胞ROS表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，不同組別細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，將DCFH-DA(10 μmol/L)加入到6孔板中，37 ℃孵育30 min，PBS清洗細(xì)胞3次，導(dǎo)入流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS測定。

1.5.3 Western blot檢測各組H9C2心肌細(xì)胞AMPK通路的蛋白表達(dá) PBS潤洗3組細(xì)胞，放置于冰上，加入RIPA裂解液提蛋白，BCA法測蛋白濃度，調(diào)整濃度一致后以2∶1的比例加入3×loading buffer,95 ℃變性5 min，制分離膠和濃縮膠，進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床上封閉2 h，4 ℃搖床上孵育一抗p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)，孵育時長12 h，PBS潤洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，PBS潤洗后ECL化學(xué)顯影，QuantityOne軟件計算各組條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2心肌細(xì)胞活性比較 CCK8檢測結(jié)果可見：與Control組相比，ODG組與Cordycepin組細(xì)胞活力值均明顯下降(均P<0.05)；與ODG組相比，Cordycepin預(yù)處理后，細(xì)胞活力值明顯提升(P<0.05)。見表1。

表1 各組H9C2心肌細(xì)胞活力值比較

2.2 各組H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)的比較 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果可見：與Control組相比，ODG組與Cordycepin組ROS表達(dá)量均明顯上升(均P<0.05)；與ODG組相比，Cordycepin預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。見圖1。

注：與Control比較,*P<0.05；與 ODG組比較,#P<0.05

2.3 各組細(xì)胞AMPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較 Western blot結(jié)果可見：相較于Control組，ODG組p-AMPK的表達(dá)未見明顯變化，Cordycepin相較于ODG組，p-AMKP/AMPK的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。見圖2。

注：與Control比較,*P<0.05；與 ODG組比較,#P<0.05

3 討論

蟲草素又稱為蟲草菌素，是提取于蛹蟲草中的活性有效成分，也可通過人工培育或生物技術(shù)獲取[9]。蟲草素分子式是C10H13N5O3,分子量為251.25，是一種核苷類似物-3’脫氧腺苷，蟲草素在近半個世紀(jì)來一直在各個領(lǐng)域得到了深入的研究，如：藥理藥效、藥物代謝、化學(xué)合成、生物合成、分離純化、理化性質(zhì)等方面[10-11]。多項國內(nèi)外的研究均表明蟲草素具有多種藥理活性，可應(yīng)用于治療多種疾病，主要的藥理學(xué)作用包括神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖、抗炎、抗菌等[12-14]。在心血管治療方面：Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)：蟲草素可激活A(yù)MPKα信號通路發(fā)揮抗心肌肥厚的保護(hù)作用；Park等[16]研究顯示蟲草素在大鼠心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮了保護(hù)作用，可能與Akt/GSK-3β/p70S6k通路的激活相關(guān)；何佛容等[17]將蟲草素應(yīng)用于老年大鼠發(fā)現(xiàn)：蟲草素有效提升了老年大鼠的心臟功能指標(biāo)，對心臟的舒張及收縮功能均有改善，同時緩解了心肌細(xì)胞的病變及結(jié)構(gòu)紊亂，其機(jī)制可能與促進(jìn)了Nrf2/HO-1通路的表達(dá)相關(guān)?；谙x草素對于心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用，本研究重點(diǎn)探討了其對心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及與ROS表達(dá)、AMPK信號通路的相關(guān)性。

ROS屬于細(xì)胞內(nèi)的信號分子，其在多種轉(zhuǎn)錄因子、離子通道、蛋白磷酸酶、蛋白激酶及蛋白受體的形成和變化過程中均發(fā)揮了重要的氧化修飾作用，參與了多條信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]。細(xì)胞內(nèi)的ROS一旦過表達(dá)會引起胞體的ATP生成不足、線粒體功能受損、蛋白過氧化、DNA損傷及脂質(zhì)氧化損傷等，最終造成細(xì)胞的凋亡[19]。AMPK具有“節(jié)能開關(guān)”的屬性，在心肌缺血再灌注損傷過程中具有保護(hù)作用，在凋亡、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪及葡萄糖代謝中均有調(diào)控作用[20]。

ROS與AMPK的表達(dá)存在雙向調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞內(nèi)ATP的消耗會引起AMPK的激活，而AMPK的濃度依賴性磷酸化由中間信使ROS誘導(dǎo)[21]。AMPK由ROS激活后參與調(diào)控了下游相關(guān)通路并進(jìn)行信息傳遞，在一定程度上也會形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)，對ROS發(fā)揮抑制作用[22]?；谝陨侠碚摚狙芯渴紫葮?gòu)建了氧化損傷的H9C2心肌細(xì)胞，在蟲草素10 μmol/L預(yù)處理后，證實蟲草素可有效提升氧化損傷H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)蟲草素可有效抑制H9C2心肌細(xì)胞的ROS表達(dá)，Western blot結(jié)果證實蟲草素預(yù)處理能夠有效地促進(jìn)AMPK通路的激活。

綜上，蟲草素預(yù)處理可有效發(fā)揮對心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與AMPK信號通路的激活相關(guān)。