利膽清胰解毒湯對急性膽源性胰腺炎大鼠炎癥因子、腸道屏障功能及TRPV1、CGRP表達(dá)的影響

林 曉，駱超風(fēng)，顧園龍

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)·浙江 杭州 310053；2臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院·浙江 臺州 317523；3臺州市立醫(yī)院·浙江 臺州 317700)

利膽清胰解毒湯是臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院自擬協(xié)定處方，具有疏肝利膽、活血止痛、清熱解毒之功效，用于治療急性膽源性胰腺炎(acute biliary pancreatitis, ABP)療效顯著[1]。本研究通過建立急性膽源性胰腺炎大鼠模型，采用利膽清胰解毒湯干預(yù)，旨在探討利膽清胰解毒湯對ABP模型大鼠炎癥因子、腸道屏障功能及TRPV1、CGRP表達(dá)的影響，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 50只清潔級健康雄性SD大鼠，7～8周齡，平均體質(zhì)量(250±20)g，由北京維通利華公司提供，動物許可證號 SCXK(京)2017-0004，室溫20～25 ℃、相對濕度40%～50%下飼養(yǎng)，通風(fēng)環(huán)境良好，自由飲水進(jìn)食。

1.2 藥物與試劑 利膽清胰解毒湯組成：金錢草、蒲公英30 g，木香、大黃各20 g，柴胡、青皮各12 g，黃芩、枳殼、郁金各9 g，梔子15 g，黃連10 g；飲片均由臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)院藥房提供，并經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)張冰教授鑒定為正品。藥材加水煎煮2次，濃縮至含生藥濃度1 g/mL。奧曲肽：北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20020229，規(guī)格：1 mL：0.1 mg。兔 TRPV1 抗體：Abcam 公司，批號：ab7247；山羊CGRP抗體：Abcam 公司，批號：ab41107；水合氯醛(分析純)：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；HE染色液：Sigma公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)和白介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素(ET)、D-乳酸(DLA)、二胺氧化酶(DAO)以及淀粉酶(AMY)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 AU5821全自動生化分析儀：貝克曼庫爾特公司；LDZ-2 型低速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；電子天平：瑞士梅特勒公司；超低溫冰箱：合肥美菱股份有限公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀：Thermo Scientific公司；SelectCycler II多通道PCR 擴(kuò)增儀：廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司；Bio-Rad電泳儀：美國伯樂公司；Cleaver凝膠成像系統(tǒng)：英國Cleaver 公司；BX53 光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司。

1.4 動物分組、造模與給藥 50只SD大鼠 隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照組(奧曲肽)、利膽清胰解毒湯低劑量組及高劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)[2]進(jìn)行造模。除正常組外，其余各組采用膽胰管結(jié)扎術(shù)，即在術(shù)前30 min給予100 μmol/kg TRPV1拮抗劑腹腔注射進(jìn)行預(yù)處理，然后在膽胰管共開口十二指腸壁縫合結(jié)扎，術(shù)后3 h進(jìn)行評估。造模成功后，正常組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃；陽性組給予50 μg/kg奧曲肽；低劑量組給予 7.2 g/kg利膽清胰解毒湯，高劑量組給予 21.6 g/kg利膽清胰解毒湯；1次/ 天，周期7 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 血清炎癥因子檢測 末次給藥后12 h,腹主動脈采血5 mL，離心，分離血清，ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.2 腸道屏障功能檢測 腹主動脈采血5 mL，離心，分離血清，采用鱟試劑酶反應(yīng)顯色法檢測血清內(nèi)毒素(ET)含量，采用酶學(xué)分光光度法檢測D-乳酸(DLA)含量,采用雙抗體夾心法檢測二胺氧化酶(DAO)含量，采用EPS-G7底物法檢測淀粉酶(AMY)含量。

1.5.3 胰腺組織病理學(xué)變化觀察 采血后處死大鼠后，取病變胰腺組織，生理鹽水清洗后，10%甲醛固定、二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠的胰腺病理組織學(xué)改變情況。大鼠胰腺病理組織評分參照 Amy法[3]，采用0～10 分制對大鼠的胰腺組織的水腫、炎癥、出血、壞死程度進(jìn)行盲法評分。

1.5.4 胰腺組織TRPV1、CGRP mRNA表達(dá) 采用Real-time PCR檢測大鼠胰腺組織 TRPV1、CGRP mRNA 表達(dá)。以R-GAPDH為內(nèi)參基因。具體步驟：提取胰腺組織總RNA，BCA 法測定蛋白濃度，Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉、加入一抗、二抗，顯色。凝膠圖像分析，使用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件分析結(jié)果灰度。計(jì)算TRPV1、CGRP相對mRNA 表達(dá)水平。其中引物TRPV1 上游5’-CTCCTGACGGCAAGGATGAC-3’、下游 5 ’-AGTTGCCTGGGTCCTCGTT-3’，擴(kuò)增片段105bp；引物CGRP上游5’-TGGTTGTCAGCATCTTGCTCC-3’，下游5 ’ - CACTGAGAGTGGCCATGCCT-3’， 擴(kuò)增片段99 bp。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算TRPV1、CGRP蛋白的相對表達(dá)水平(p)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清炎癥因子含量比較 見表1。

表1 各組大鼠血清炎癥因子含量比較

2.2 各組大鼠腸道屏障功能比較 見表2。

表2 各組大鼠腸道屏障功能指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)變化觀察結(jié)果 正常對照組大鼠胰腺小葉、腺體和胰島結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠胰腺腺體壞死，結(jié)構(gòu)不清，小葉間隙明顯增寬，炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)內(nèi)可見出血、小血管壞死。陽性對照組、利膽清胰解毒湯低劑量組及高劑量組大鼠胰腺腺體壞死明顯減輕，小葉間隙明顯變窄，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，高劑量組大鼠的胰腺改變尤其明顯。見圖1。各組大鼠胰腺病理變化評分見表3。

圖1 各組大鼠的胰腺組織病理變化(HE，×100)

表3 各組大鼠胰腺組織病理評分比較

2.4 各組大鼠胰腺組織TRPV1、CGRP表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果 見圖2，表4。

圖2 各組大鼠胰腺組織TRPV1、CGRP、電泳圖

表4 各組大鼠胰腺組織TRPV1、CGRP表達(dá)比較

3 討論

急性膽源性胰腺炎(acute biliary pancreatitis, ABP)是指膽道系統(tǒng)炎癥、結(jié)石或膽管結(jié)構(gòu)異常等各種膽管疾病所導(dǎo)致的急性胰腺炎，其發(fā)病急促，進(jìn)展迅速，如治療不及時，可致感染、休克甚至死亡。ABP是急性胰腺炎中最常見類型，約占60%，其發(fā)病機(jī)制與結(jié)石活動密切相關(guān)[4]。目前醫(yī)學(xué)界認(rèn)為繼發(fā)炎癥因子異常釋放和腸道屏障功能損傷在ABP進(jìn)展過程中起重要作用[5]。西醫(yī)治療以抑抑制胰蛋白酶消化、抗感染及抑制胃酸分泌等藥物為主，雖有一定的臨床效果，但胰腺功能損傷難以減輕，遠(yuǎn)期預(yù)后改善效果欠佳。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，ABP病因?yàn)槠⑽甘С?，陰津耗灼，熱毒?nèi)蘊(yùn)，內(nèi)陷心包所致[6]，治療宜利膽解毒。

研究發(fā)現(xiàn)，ABP患者起病時，TNF-α、IL-6 以及IL-1β水平即出現(xiàn)異常[7]。TNF-α是ABP炎癥反應(yīng)最重要始動細(xì)胞因子之一，可預(yù)測病情嚴(yán)重程度；降低IL-6和IL-1β水平可減輕發(fā)病ABP患者的胰腺組織及周圍臟器損傷[8]。IL-10水平可敏感反映ABP患者機(jī)體免疫系統(tǒng)功能[9]。腸道黏膜屏障功能是反應(yīng)急性胰腺炎發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵，其有效指標(biāo)為ET、DLA、DAO以及AMY；其中ET與腸壁血管通透性密切相關(guān)，當(dāng)腸道屏障功能受損時，細(xì)胞發(fā)酵的代謝產(chǎn)物DLA可大量入血，加速腸道受損程度[10-11]；腸道機(jī)械屏障完整性與DAO密切相關(guān)[12]；AMY可作為早期急性胰腺炎診斷的有效指標(biāo)[13]。急性胰腺炎發(fā)病過程中TRPV1、CGRP起著關(guān)鍵作用。TRPV1主要分布于肽能神經(jīng)元中，是負(fù)責(zé)傳遞熱傷害感受，激活后引發(fā)細(xì)胞外鈣內(nèi)流，促發(fā)或調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)事件。TRPV1參與胰腺感覺神經(jīng)元的敏化和神經(jīng)源性炎癥的發(fā)生，在胰腺炎內(nèi)臟疼痛和痛覺過敏發(fā)病機(jī)理中至關(guān)重要[14]。CGRP是重要的具有負(fù)向調(diào)節(jié)功能的免疫調(diào)節(jié)肽，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡。CGRP參與急性胰腺炎的疼痛、炎癥等病理過程同時，還防止致炎因子對神經(jīng)元的造成損傷[15]。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1、CGRP表達(dá)與胰腺炎病理改變呈正相關(guān)[16]。奧曲肽為一種人工合成八肽環(huán)狀化合物，具有與天然內(nèi)源性生長抑素的作用，但作用較強(qiáng)且持久，可明顯抑制胃腸道和胰內(nèi)激素的病理性分泌過多，降低胃腸道運(yùn)動和膽囊排空，對胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞有直接保護(hù)作用[17]。

中醫(yī)認(rèn)為ABP屬“胃心痛” “脾心痛”“腹痛”等范疇。郁、毒、熱、瘀互結(jié)是其病因病機(jī)[18]，故治療應(yīng)以疏肝解郁、活血化瘀、清熱解毒為主。利膽清胰解毒湯具有疏肝利膽、活血化瘀止痛、清熱解毒之功效。其中柴胡疏肝解郁；金錢草利膽排石；大黃活血化瘀，泄陽明腑實(shí)熱；木香、青皮、枳殼行氣止痛、健脾消食，助柴胡疏肝理氣，調(diào)理氣機(jī)；郁金活血涼血止痛，行氣解郁，利膽退黃，助金錢草排石；梔子清三焦之熱，涼血解毒；黃芩、蒲公英、黃連清熱解毒；諸藥合用，以達(dá)到疏肝利膽、活血化瘀、行氣止痛、清熱解毒之功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，柴胡、黃芩以及大黃可明顯減少胃液和胰液的分泌量，促進(jìn)胰腺恢復(fù)，其主要作用于 PTGS2、DPP4、PRSS1、RELA、VEGFA 等靶點(diǎn)[19-22]；金錢草具有較強(qiáng)排石作用，并有抗菌、鎮(zhèn)痛功效[23]；青皮、枳殼可促進(jìn)膽汁分泌、同時具有抗炎、鎮(zhèn)痛功效，并保護(hù)肝細(xì)胞[24]；蒲公英、黃連、木香以及郁金具有廣譜的抗菌、抗炎作用，消除體內(nèi)內(nèi)毒素[25-26]。

本文結(jié)果顯示：利膽清胰解毒湯可有效降低急性膽源性胰腺炎模型大鼠血清炎癥因子水平，增強(qiáng)腸道屏障功能，減輕胰臟組織損傷，減少胰腺組織TRPV1、CGRP表達(dá)；對治療急性膽源性胰腺炎具有較高的臨床應(yīng)用價值，其他作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。