蠶豆苗提取物對帕金森病的保護作用

劉雪城，金皓潔，陳彬輝，何凌云, ，劉陶世

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023；

2.南京艾德凱騰生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，江蘇南京 211100）

帕金森病是一種以黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的進行性變性為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是僅次于阿爾茲海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病[1-2]。目前帕金森病的病因尚不完全清楚，一般認為氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙和神經(jīng)營養(yǎng)因子不足等參與該疾病的發(fā)生、發(fā)展[3-5]。研究表明，食用富含黃酮與酚酸類等生理活性成分的物質(zhì)能夠保護神經(jīng)細胞、改善帕金森病相關(guān)癥狀。石榴汁中含有黃酮和酚酸，能夠顯著降低帕金森小鼠模型活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、丙二醛水平、提高抗氧化酶活性、改善氧化應(yīng)激[6]。銀杏葉提取物對魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型具有明顯的神經(jīng)保護作用，能夠提高抗氧化酶活性、降低促炎細胞因子的水平，改善氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)[7]。蒲葵子總黃酮可通過調(diào)控BLACAT1/miR-29c-3p分子軸，抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細胞瘤細胞氧化應(yīng)激、凋亡，進而保護神經(jīng)細胞[8-9]。

蠶豆，為豆科野豌豆屬植物Vicia fabaL.的種子[10-11]，屬藥食兩用，性味平甘，具有益氣健脾和清熱止血功效。蠶豆苗是蠶豆發(fā)芽后的嫩莖葉。研究顯示，蠶豆苗中不僅含有大量的左旋多巴，還含有對帕金森病具有保護作用的原花青素和黃酮類等成分[12-17]。左旋多巴是目前治療帕金森病的金標準，患者服用左旋多巴后經(jīng)體內(nèi)多巴胺脫羧酶轉(zhuǎn)化成多巴胺，從而發(fā)揮其藥理作用。本研究以蠶豆苗提取物（Broad bean seedling extract，BSE）為研究對象，擬實驗觀察BSE對帕金森病的影響，并初步探討其可能的作用機制。PC-12細胞和SH-SY5Y細胞是常用的兩種神經(jīng)細胞[18-19]，適用于藥物神經(jīng)保護作用研究。本論文重點探討B(tài)SE對這兩種神經(jīng)細胞的保護作用以及對帕金森病小鼠模型的影響[20-22]，為闡明BSE治療帕金森綜合征的作用機理及其產(chǎn)品研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

蠶豆苗提取物 自制取45～50cm高的蠶豆苗適量，洗凈，切成小段，榨汁，合并蠶豆苗汁，煮沸3～5 min，過濾，得濾液。將濾液減壓濃縮，真空干燥，得BSE 16 g。采用HPLC法測得蠶豆苗提取物中左旋多巴為含量4.99%，采用紫外-可見分光光分度測定BSE中總黃酮、異黃酮和原花青素的含量分別為18.07%、1.20%和0.45%；PC-12細胞、SH-SY5Y細胞 均采購于凱基生物科技發(fā)展有限公司；C57BL/6小鼠 由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，周齡：4～5 周健康小鼠，體重：16～18 g，性別：雄性，動物數(shù)：每組 6 只，共 30 只，自由供給標準飼料和純凈水，保持12 h光照（9:00～21:00）和 12 h黑暗（21:00～次日 9:00）交替循環(huán)，室溫20～23 ℃，濕度55%±10%。動物適應(yīng)環(huán)境5 d后開始實驗，實驗過程嚴格遵守3R原則；D0600左旋多巴 日本東京化成工業(yè)株式會社；6-羥基多巴胺、SIGMAD2650二甲亞砜DMSO（溶解受試藥品）美國 Sigma-Aldrich；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MolT4081/23007-85-4100 mg） 美國 Target；四甲基偶氮唑鹽MTT 美國Amresco0793；二甲亞砜DMSO（溶解Formazan結(jié)晶） 中國上海久億化學(xué)試劑有限公司；KGT010-1活性氧檢測試劑盒、KGY002青霉素/鏈霉素溶液、KGY001 0.25%胰蛋白酶-EDTA、KGB500 PBS、KGA602線粒體膜電位檢測試劑盒、KGA105 Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒 中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

SW-CJ-1FD超凈工作臺 中國蘇州凈化設(shè)備有限公司；OLYMPUS IX51生物倒置顯微鏡 日本奧林巴斯；ELx800酶標儀 美國BioTek；WH-2振蕩器 中國上海滬西分析儀器廠；通風(fēng)櫥 中國蘇州億達；Becton-Dickinson FACSCalibur流式細胞儀美國BD公司；XD-101CO2培養(yǎng)箱 日本SANYO；80-2臺式低速離心機 中國上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-LS-50立式壓力鍋 中國上海博訊。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法研究BSE對帕金森模型細胞增殖的影響

1.2.1.1 造模與給藥濃度 經(jīng)過前期預(yù)實驗，6-羥基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）的造模濃度選擇為50 μmol/L，該濃度對PC-12細胞和SH-SY5Y細胞的抑制率分別為37.65%和42.79%。BSE的安全給藥濃度梯度選擇為 5、10、20、40、80、160 μg/mL。

1.2.1.2 實驗分組及處理 將凍存的PC-12細胞和SH-SY5Y細胞，分別迅速放入37 ℃恒溫水中解凍，并緩緩搖動試管，使其快速融化。吸出融化的細胞懸液注入到3 mL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，在4 ℃條件下1000 r/min離心5 min，棄去上清溶液；將余下的細胞沉淀置于1 mL培養(yǎng)基中，輕輕吹打使其成為單細胞懸液。吸取單細胞懸液并加入到培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液至6 mL，搖勻靜置3 min，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h以上。

將穩(wěn)定生長的PC-12細胞和SH-SY5Y細胞，分別從培養(yǎng)箱中取出，緩慢加入PBS清洗兩遍，棄去PBS；加入預(yù)熱的胰蛋白酶2 mL后置于CO2培養(yǎng)箱中消化，當觀察細胞完全脫離瓶壁后終止消化；加入3 mL培養(yǎng)基，吹打細胞使其成單細胞懸液。1000 r/min離心5 min，棄去上清，在細胞沉淀中加入1 mL培養(yǎng)基混勻成細胞懸液；經(jīng)過計數(shù)板處理，在顯微鏡下觀察細胞計數(shù)。計算并配制濃度為5×104個/mL細胞懸液，分別于96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細胞懸液；并將培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

將上述96孔細胞培養(yǎng)板中的PC-12細胞和SH-SY5Y細胞，分別分為8組，其中空白對照組和模型對照組每孔細胞分別加入100 μL不含藥的空白培養(yǎng)基，6個給藥組每孔細胞分別加入100 μL含BSE濃度為 5、10、20、40、80、160 μg/mL的培養(yǎng)基；將96孔細胞培養(yǎng)板置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，模型組與給藥組各加入50 μmol/L 6-OHDA造模24 h，空白對照組加入等體積PBS；將 96孔板每孔細胞加入 20 μL MTT（5 mg/mL）進行染色，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO進行溶解，搖床10 min輕輕混勻；利用酶標儀檢測每孔OD值，λ=490 nm。根據(jù)測得的吸光度值（OD值），Ai來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞活性越強。分別計算各組別細胞增殖抑制率。

式中：W表示細胞增殖抑制率，%；Ai表示給藥組或模型對照組測得的吸光度值（O值）；A0表示空白對照組測得的吸光度值（OD值）。

1.2.2 蠶豆苗提取物對帕金森模型細胞活性氧含量（ROS）、線粒體膜電位以及凋亡率影響的實驗 按1.2.1項下培養(yǎng)細胞。將96孔細胞培養(yǎng)板中的PC-12細胞和SH-SY5Y細胞分別分為6組，其中空白對照組與模型對照組加入100 μL不含藥的空白培養(yǎng)基，左旋多巴陽性對照組（4 μg/mL），BSE 5、20、80 μg/mL組分別加入100 μL含藥培養(yǎng)基。各組細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將模型對照組與各給藥組加入50 μmol/L 6-OHDA作用24 h，空白對照組加入等體積PBS。然后分別在各孔中加入0.25%胰酶（不含EDTA）消化細胞，用PBS洗滌細胞一次，1000 r/min離心5 min，收集并調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。采用活性氧檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測各組細胞的ROS值、線粒體膜電位和細胞凋亡情況[23-24]。

1.2.3 蠶豆苗提取物（BSE）對MPTP誘導(dǎo)帕金森病小鼠模型的影響

1.2.3.1 分組與造模給藥 健康C57BL/6小鼠30只，隨機分為5組，每組6只，分別為空白對照組、模型對照組、左旋多巴陽性對照組25 mg/kg、BSE高劑量組500 mg/kg、BSE低劑量組300 mg/kg。每次灌胃藥液體積為0.2 mL，空白對照組和模型對照組每次灌服等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥19 d，給藥前后不禁食不禁水。其中在第11～15 d灌胃給藥1 h后，除空白對照組注射等體積生理鹽水外，其余各組小鼠每天腹腔注射30 mg/kg 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）一次，連續(xù)注射 5 d[21-22,25-27]。

1.2.3.2 行為學(xué)檢測 抓力試驗[28]：將受試小鼠放置于拉力儀上，抓住小鼠尾部，向后直線拉拽，記錄抓力數(shù)據(jù)。在給藥第8d測定所有小鼠抓力大小，并在第15 d給藥后，再次測定其抓力。

爬桿實驗[29-30]：取直徑1 cm、高50 cm、頂部有一直徑3 cm木球的光滑木桿。測試時將被測小鼠置于軟木小球上，記錄小鼠爬到桿底所需要的時間，在給藥第8 d測定所有小鼠爬桿時間，并在第18 d給藥1 h后，再次測定其爬桿時間。并對爬桿時間進行評分測試，三秒鐘內(nèi)爬一半者記3分，6 s內(nèi)爬一半者記2分，超過6 s則記1分，重復(fù)三次，取平均值。

轉(zhuǎn)軸實驗[31]：將小鼠置于轉(zhuǎn)棒上，測試小鼠從轉(zhuǎn)棒開始旋轉(zhuǎn)到從轉(zhuǎn)棒上掉落的時間。在給藥第8 d測定所有小鼠轉(zhuǎn)軸時間，并在第19 d給藥1 h后，測定其轉(zhuǎn)軸時間。

行為學(xué)檢測項目，若于同一天測定抓力試驗、爬桿實驗、轉(zhuǎn)軸實驗三項行為學(xué)指標，實驗結(jié)果會因小鼠疲勞而失真，因此分3 d測定。

1.2.3.3 氧化應(yīng)激因子的檢測 行為學(xué)實驗后，將各組小鼠斷頭取腦組織，制備組織勻漿，低溫離心，取上清液，采用Bradford定量蛋白法測定各樣本光吸收度值，檢測各組小鼠腦組織中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）的含量變化[32-33]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 23 統(tǒng)計軟件、Graphpad prism 8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析與圖表繪制，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，所有實驗均重復(fù)3次以上，當數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布與方差齊性時，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett-t檢驗進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSE對神經(jīng)細胞增殖的影響

圖1結(jié)果顯示，經(jīng) 6-OHDA作用后，PC-12和SH-SY5Y兩種神經(jīng)細胞的增殖均受到明顯抑制，其抑制率與空白對照組比較，呈極顯著上升（P＜0.01），表明6-OHDA可誘導(dǎo)神經(jīng)細胞損傷。BSE不同濃度給藥組神經(jīng)細胞的增殖抑制率極顯著小于模型對照組（P＜0.01），且呈BSE濃度相關(guān)性，表明BSE對神經(jīng)細胞損傷具有較好的保護作用。

圖1 蠶豆苗提取物對6-OHDA損傷PC-12和SH-SY5Y細胞的保護作用Fig.1 Protective effect of broad bean seedling extract on PC-12 and SH-SY5Y cells damaged by 6-OHDA

6-OHDA能夠?qū)е录毎装Y、產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而引起線粒體功能受損，進而激活凋亡級聯(lián)通路，造成多巴胺能神經(jīng)元的死亡。研究表明，植物中提取的黃酮和酚類化合物能夠緩解細胞炎癥、降低氧化應(yīng)激，保護神經(jīng)細胞的線粒體功能，改善6-OHDA導(dǎo)致的神經(jīng)細胞增殖抑制[2,4]。BSE對神經(jīng)細胞的保護作用，可能和上述機制有關(guān)。

2.2 BSE對神經(jīng)細胞ROS、線粒體膜電位的影響

活性氧檢測試劑盒是一種利用熒光探針DCFHDA進行活性氧檢測的試劑盒。在活性氧存在的條件下，DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比。線粒體膜電位檢測試劑盒是一種利用熒光探針JC-1進行線粒體膜電位的檢測的試劑盒，線粒體膜電位下降時，表現(xiàn)為JC-1單體比例升高，綠色熒光強度增強。正常線粒體內(nèi)，JC-1形成聚合物，表現(xiàn)為紅色熒光強度增強或綠色熒光強度減弱。

由圖2可知，經(jīng)6-OHDA作用后，促使PC-12和SH-SY5Y細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)的熒光強度增強，活性氧含量升高，且極顯著高于空白對照組（P＜0.01）。高活性氧引起線粒體功能損傷，表現(xiàn)為JC-1單體比例升高，綠色熒光強度增強，線粒體膜電位下降（P＜0.01），促進細胞的進一步凋亡。與模型組比較，BSE兩濃度（20和80 μg/mL）下均能夠抑制線粒體膜電位下降，且具有極顯著差異（P＜0.01），5 μg/mL BSE 無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，BSE各濃度干預(yù)組與左旋多巴組均能夠抑制6-OHDA造成的活性氧水平升高（P＜0.01），表明BSE和左旋多巴在保護線粒體功能和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)具有較好的效果。

圖2 BSE對神經(jīng)細胞ROS、線粒體膜電位的影響Fig.2 Effects of BSE on neuronal ROS and mitochondrial membrane potential

2.3 BSE對神經(jīng)細胞凋亡的影響

線粒體損傷與氧化應(yīng)激能夠造成細胞損傷和凋亡。由圖3可知，經(jīng)過6-OHDA作用后，PC-12、SHSY5Y細胞凋亡率極顯著增加（P＜0.01）。與模型對照組相比，BSE兩個濃度20和80 μg/mL干預(yù)組和左旋多巴組均能夠顯著抑制PC-12、SH-SY5Y細胞凋亡（P＜0.05），5 μg/mL BSE 抑制神經(jīng)細胞凋亡作用不顯著（P＞0.05），且BSE干預(yù)組呈濃度相關(guān)性。結(jié)果還顯示，20和80 μg/mL BSE抗凋亡效應(yīng)要顯著優(yōu)于左旋多巴陽性組（P＜0.05），這進一步表明BSE中除左旋多巴外，還有其他成分參與其抗神經(jīng)細胞凋亡的作用。

圖3 蠶豆苗提取物對神經(jīng)細胞凋亡的影響Fig.3 Effects of broad bean extract on apoptosis of neuro cells

2.4 BSE對MPTP誘導(dǎo)帕金森病模型小鼠的影響

2.4.1 BSE對帕金森模型小鼠行為學(xué)的影響 圖4結(jié)果表明，小鼠注射MPTP后，明顯出現(xiàn)爬桿、轉(zhuǎn)軸、抓力等行為障礙，說明MPTP引起小鼠行為異常，帕金森病小鼠模型復(fù)制成功。與模型對照組比較，BSE各給藥組小鼠行為學(xué)障礙得到改善，且高劑量組（500 mg/kg）效果更加顯著，數(shù)據(jù)具有極顯著性差異（P＜0.01）。左旋多巴25 mg/kg對小鼠行為障礙的改善作用不如BSE給藥組（P＜0.01），這再次提示BSE中除了左旋多巴成分外，還含有其他成分參與對神經(jīng)細胞的保護。

圖4 蠶豆苗提取物對帕金森病模型小鼠的影響Fig.4 Effects of broad bean extract on Parkinson's disease in mice

2.4.2 BSE對帕金森病模型小鼠紋狀體中SOD、GSH-Px和MDA含量的影響 由圖5可知，正常小鼠經(jīng)過MPTP注射后，小鼠大腦紋狀體中SOD和GSH-Px水平下降，MDA含量升高，說明MPTP能夠?qū)е滦∈笊窠?jīng)細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生神經(jīng)細胞毒性，損傷了神經(jīng)元。與模型對照組比較，BSE兩劑量組均能使帕金森癥小鼠紋狀體的SOD和GSHPx水平上升，且降低MDA含量，經(jīng)統(tǒng)計均具有極顯著差異（P＜0.01）；左旋多巴對帕金森癥小鼠表現(xiàn)出同樣的作用。

圖5 蠶豆苗提取物對帕金森病模型小鼠紋狀體中SOD，MDA和GSH-Px含量的影響Fig.5 Effects of broad bean extracton the contents of SOD, MDA and GSH-Px in striatum of Parkinson's model mice

3 討論與結(jié)論

帕金森病最主要的病理改變是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，進而導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量顯著性減少而致病。

本文采用6-OHDA誘導(dǎo)PC-12和SH-SY5Y兩種神經(jīng)細胞損傷，造成線粒體膜電位降低、ROS水平升高，神經(jīng)細胞凋亡增加，從而抑制其增殖作用[18,34]。BSE能夠提高PC-12和SH-SY5Y神經(jīng)細胞的線粒體膜電位，降低 ROS 水平，抑制模型細胞凋亡，從而有利于神經(jīng)細胞的增殖，對神經(jīng)細胞有明顯的保護作用。

本文采用MPTP腹腔注射建立帕金森小鼠模型，小鼠出現(xiàn)明顯的行為障礙、腦組織SOD和GSHPx水平下降、MDA含量升高[25,35,36]。BSE能改善MPTP致帕金森病模型小鼠的行為障礙，提高小鼠腦組織SOD和GSH-Px水平，降低MDA含量，明顯地抑制小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化。

上述研究證實了BSE對神經(jīng)細胞的保護作用，同時BSE能顯著改善帕金森小鼠的行為障礙，且這一作用可能與降低腦紋狀體MDA水平、升高SOD和GSH-Px相關(guān)，體現(xiàn)了BSE的抗氧化作用。研究表明，許多植物中的總黃酮、總酚提取物能夠明顯減輕神經(jīng)細胞損傷，抑制線粒體功能障礙，對帕金森動物模型具有顯著改善[6-8]。蠶豆苗中亦含有豐富的酚類與黃酮類物質(zhì)[12,17,37]，這應(yīng)該是其發(fā)揮抗帕金森病效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

此外，蠶豆苗中還含有左旋多巴，這是療效明確的帕金森治療藥物。本研究以左旋多巴組為陽性對照，且劑量與BSE高劑量組中所含左旋多巴相同，旨在探討蠶豆苗提取物中除左旋多巴外，其它成分（黃酮類和酚類）是否對損傷的神經(jīng)細胞和帕金森小鼠模型具有保護作用，這些成分是否能與左旋多巴發(fā)揮協(xié)同增效作用。研究結(jié)果表明，BSE對神經(jīng)細胞的保護作用以及對帕金森小鼠行為的改善作用均要優(yōu)于左旋多巴單用，這一結(jié)果顯示BSE中的黃酮類和酚類成分參與了BSE的抗帕金森病作用。當然，BSE中的黃酮類和酚類成分中具體發(fā)揮神經(jīng)細胞保護和抗帕金森癥的單體成分及其詳細作用機理還有待進一步研究。