胃腸道調(diào)理專用奶粉對便秘小鼠腸道動(dòng)力和菌群組成的影響

許賀志翔，楊曉君，沙迪昕，麥迪乃·吾秀爾

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

目前功能性奶粉中添加的功能因子較多，常見的包括糖類、膳食纖維素、多肽、植物蛋白、益生元類、益生菌[1-3]。奶粉具有各營養(yǎng)要素均衡全面的特點(diǎn)，通過在奶粉中額外增添益生元或益生元聯(lián)合不飽和脂肪酸，是協(xié)助改善胃及腸道功能和穩(wěn)定腸道菌群的功能性乳制品開發(fā)的新方向，同時(shí)是國內(nèi)乳品生產(chǎn)企業(yè)的新的熱點(diǎn)。

低聚糖和不飽和脂肪酸已廣泛運(yùn)用于調(diào)制乳粉、奶粉、乳飲料等產(chǎn)品中[4-7]。一般認(rèn)為功能性低聚糖能特異性誘導(dǎo)腸道內(nèi)益生菌的生長，同時(shí)具有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)和潤腸功效[8-10]。低聚果糖具有能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群的作用[11]。目前其當(dāng)做食品配料或輔料，通常在乳品及特定營養(yǎng)保健功能食品有較多應(yīng)用[12-14]。低聚木糖是良好的益生菌增殖的功能因子之一[15]。不飽和脂肪酸也是常添加的功能因子，其中亞油酸具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，被廣泛用作食品營養(yǎng)補(bǔ)充劑[16]。

關(guān)于添加復(fù)配低聚果糖和低聚木糖這種益生元的奶粉達(dá)到胃腸道調(diào)理功效的研究目前已有報(bào)導(dǎo)，但將功能性低聚糖和不飽和脂肪酸組合研究較少，國內(nèi)外研究人員對單一和復(fù)合益生元的胃腸道調(diào)理潤腸通便功能進(jìn)行了大量研究報(bào)道，但由于目前低聚糖種類繁多，研究結(jié)果也不盡相同。且大都集中在嬰幼兒配方奶粉，對針對成人設(shè)計(jì)的胃腸道調(diào)理專用奶粉研究較少。侯艷梅等[17]發(fā)明了一款促進(jìn)腸道健康的配方奶粉，在其中添加了酪蛋白巨肽和益生元，對腸道健康的促進(jìn)具有顯著效果。劉紹君等[18]發(fā)明了一款益于中老年人腸道健康的奶粉，在其中添加了菊粉和寡糖等功能因子，具有調(diào)節(jié)消化道微生物群的作用。黃新紅等[19]發(fā)明了一款中老年配方奶粉，在其中添加了可溶性膳食纖維，改善中老年人腸道健康。Maganha等[20]對奶粉中添加益生菌后，益生菌的生存力和奶粉功效進(jìn)行了探討。Angeles-Agdeppa[21]選定患有功能性便秘的菲律賓母親為實(shí)驗(yàn)對象，規(guī)定實(shí)驗(yàn)對象定期飲用含有益生菌和纖維素添加因子的奶粉，發(fā)現(xiàn)含有益生菌和纖維素添加因子的奶粉對實(shí)驗(yàn)對象的功能性便秘癥狀具有一定的改善作用。

本試驗(yàn)主要通過對小鼠腸道菌群變化情況和胃腸道調(diào)節(jié)功能的測定，來探究胃腸道調(diào)理專用奶粉對腸道益生作用的影響，以期為充分利用功能性低聚糖和不飽和脂肪酸，開發(fā)功能性乳粉和新產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

KM小鼠 72只，均為雌性，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002，該動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：2021003），適應(yīng)3 d，自由飲食；自制胃腸道調(diào)理專用奶粉 原料來自新疆西域春乳業(yè)有限公司；奶粉市售，蒙牛公司的一款中老年奶粉（含有一定量的低聚糖和膳食纖維），生產(chǎn)批號(hào)：10707CA1；伊文思藍(lán)上海源葉生物有限公司；鹽酸洛哌丁胺 西安楊森有限公司。

多功能渦旋混勻儀（VM505） 寧波市鄞州區(qū)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；糞便DNA提取試劑盒 賽默飛公司；MiSeq測序儀 Illumina公司；Agilent Bioanalyzer 2100 美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胃腸道調(diào)理專用奶粉的配制 將新鮮原料奶進(jìn)行噴霧干燥，得到噴霧干燥后的全脂奶粉，以30 g計(jì)各組分添加量分別為，乳固體添加量81.3%（由全脂奶粉和乳清蛋白粉組成）、低聚糖添加量6%（低聚果糖與低聚木糖）、共軛亞油酸甘油酯微囊粉添加量10%、麥芽糊精添加量2.7%。利用實(shí)驗(yàn)室混勻儀采用干混工藝將不同原料進(jìn)行混勻。

1.2.2 動(dòng)物分組及造模 將72只小鼠隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組12只。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模方法參考方圓之等[22]的方法，略做改動(dòng)。空白組（0.9%生理鹽水）、模型組（0.9%生理鹽水+9.38 mg/kg BW鹽酸洛哌丁胺）、陽性對照組（1.25 g/kg BW市售奶粉+9.38 mg/kg BW鹽酸洛哌丁胺）、低劑量組（0.625 g/kg BW自制專用奶粉+9.38 mg/kg BW鹽酸洛哌丁胺）、中劑量組（1.25 g/kg BW自制專用奶粉+9.38 mg/kg BW鹽酸洛哌丁胺）、高劑量組（2.5 g/kg BW自制專用奶粉+9.38 mg/kg BW鹽酸洛哌丁胺）。

第1 d開始除空白組其他各組灌服鹽酸洛哌丁胺9.38 mg/kg BW，每日兩次連續(xù)7 d。第8 d開始邊造模邊給藥，在每日灌服造模藥物的同時(shí)，空白組和模型組給予0.9%生理鹽水，奶粉每日攝入30 g/60 kg/d，相當(dāng)于0.5 g/kg BW，分別按推薦量的1.25、2.5、5倍設(shè)置3個(gè)劑量，低劑量組為1.25倍人體推薦攝入量攝入專用奶粉0.625 g/kg，小鼠給藥濃度0.28 g/mL；陽性對照組和中劑量組為2.5倍人體推薦攝入量攝入專用奶粉1.25 g/kg，小鼠給藥濃度0.56 g/mL；高劑量為5倍人體推薦攝入量攝入專用奶粉2.5 g/kg，小鼠給藥濃度1.13 g/mL；連續(xù)灌服至第14 d。

1.2.3 一般狀態(tài) 每日觀察實(shí)驗(yàn)組及空白組小鼠活動(dòng)狀態(tài)情況、毛發(fā)顏色變化、體重量變化。實(shí)驗(yàn)過程中稱量每只動(dòng)物的體重量并記錄，分別計(jì)算比較空白、其他各組之間體重變化。

1.2.4 專用奶粉對小鼠組織器官的安全性評價(jià) 連續(xù)灌胃第14 d后，隨機(jī)取造模小鼠、空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的小鼠各兩只，通過脊柱脫位處死動(dòng)物并打開腹腔以取出各小鼠的小腸，之后進(jìn)行組織切片觀察。

1.2.5 胃腸道調(diào)理專用奶粉對洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘小鼠的腸道菌群影響 第14 d后，新鮮小鼠糞便通過按壓和腹部按摩收集至無菌EP管，液氮速凍糞便，與-80 °C冰箱保存。每組隨機(jī)抽三個(gè)樣本通過干冰寄送方式，送至上海生工有限公司。進(jìn)行16S微生物分類和測序。提供樣本DNA并對V3～V4區(qū)域進(jìn)行16S rRNA基因測序，引物序列為：341F：CCTA CGGGNGGCWGCAG；805R：GACTACHVGGGTA TCTAATCC。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到測序器以建立測序數(shù)據(jù)庫并在Illumina平臺(tái)上對其進(jìn)行測序。

1.2.6 小鼠排便實(shí)驗(yàn) 在1.2.5實(shí)驗(yàn)后，各小組小鼠禁食但正常飲水12 h，除空白組，其他各組小鼠灌服鹽酸洛哌丁胺（9.38 mg/kg BW）30 min后灌服0.4%的伊文思藍(lán)（10 mL/kg BW）并開始計(jì)時(shí)，單個(gè)飼養(yǎng)每只實(shí)驗(yàn)老鼠，自由進(jìn)食和飲水，觀察并記錄第一次排便時(shí)間、第一次排藍(lán)便時(shí)間及6 h排便總粒數(shù)。

1.2.7 小鼠小腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)參考彭禛菲等[23]的腸推進(jìn)方法。在1.2.6實(shí)驗(yàn)后，各小組小鼠禁食但正常飲水12 h，除空白組，其他各組小鼠灌服鹽酸洛哌丁胺（9.38 mg/kg BW）30 min后灌服0.4%的伊文思藍(lán)（10 mL/kg BW），20 min后，處死實(shí)驗(yàn)各組小鼠。打開其腹腔，收集從幽門到回盲部的腸道。輕輕拉直腸道，測量小腸的總長度，計(jì)算伊文思藍(lán)在小鼠小腸內(nèi)的推進(jìn)率。

伊文思藍(lán)推進(jìn)概率（%）=伊文思藍(lán)推進(jìn)長度（cm）/小腸總長度（cm）×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 26和R 4.1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，組間差異分析采用t檢驗(yàn)方法。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀態(tài)

整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，小鼠基本狀態(tài)正常，活動(dòng)量、毛色均無異常。由表1顯示，在實(shí)驗(yàn)前各組小鼠之間無顯著性差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)14 d后空白組與模型組、陽性對照組、低劑量組差異顯著（P＜0.05），表明鹽酸洛哌丁胺對小鼠體重有一定影響，從體重增長數(shù)值看，鹽酸洛哌丁胺會(huì)減緩小鼠體重增長速度。這一結(jié)論與黃小麗等[24]在研究造模組與空白組在體重、糞便含水量及口肛傳輸時(shí)間上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異結(jié)論相一致。此外，實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠的糞便形狀正常，未出現(xiàn)便秘、腹瀉以及未出現(xiàn)其他不良癥狀，表明復(fù)配功能性低聚糖和共軛亞油酸的胃腸道調(diào)理專用奶粉對小鼠生長狀況無不良影響。

表1 各組小鼠體重變化（1～14 d，n=10）Table 1 Weight changes of mice in each group (1～14 d, n=10)

2.2 胃腸道調(diào)理專用奶粉對小鼠的安全性評價(jià)

從圖1中可以看出，各劑量組小鼠小腸壁杯狀細(xì)胞完整，空白組、陽性對照組和各劑量組沒有明顯差異，說明添加兩種低聚糖和共軛亞油酸的專用奶粉對小鼠的小腸沒有損壞。此結(jié)論與李艷莉[25]在探究不同劑量功能性低聚糖對小鼠腸道影響的結(jié)果相類似。

圖1 實(shí)驗(yàn)各組小鼠小腸組織切片圖Fig.1 Small intestinal tissue section of experimental groups

2.3 胃腸道調(diào)理專用奶粉對洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘小鼠的腸道菌群16S rDNA測序結(jié)果分析

2.3.1 糞便樣本α多樣性分析 本研究使用Shannon多樣性指數(shù)（Shannon diversity index）、Faith的系統(tǒng)發(fā)育距離指數(shù)（Faith's phylogenetic distance index）和Pielou的均勻度指數(shù)（Pielou's evenness index）來評估Alpha多樣性，以評估腸道菌群豐富度和均勻度變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過鹽酸哌羅丁胺藥物灌胃構(gòu)建小鼠便秘模型并不能改變小鼠的腸道菌群豐富度和均勻度。與便秘小鼠相比，給予市售奶粉、低中高劑量的自制奶粉對便秘小鼠腸道菌群豐富度和均勻度也無顯著影響。Alpha多樣性分析結(jié)果見表2。

表2 Alpha多樣性分析Table 2 Alpha diversity analysis

2.3.2 糞便樣本Beta多樣性分析 基于Weighted UniFrac和Bray-Curtis距離的Beta多樣性分析用于評估腸道菌群的組間差異，并通過主坐標(biāo)分析法（principal co-ordinates analysis，PCoA）進(jìn)行降維可視化。PCoA分析中發(fā)現(xiàn)：樣本在空白組、便秘模型組、便秘模型+市售奶粉組、便秘模型+低劑量自制奶粉組、便秘模型+中劑量自制奶粉組、便秘模型+高劑量自制奶粉組均表現(xiàn)出明顯的聚類（圖2）。PERMANOVA方法進(jìn)行組間的差異比較發(fā)現(xiàn)各組間腸道菌群組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異（PERMANOVA，P-value=0.001）。基于Bray-Curtis距離的相似性分析（Analysis of Similarities，ANOSIM）發(fā)現(xiàn)組間差異大于組內(nèi)差異（Bray-Curtis: R=0.65，P＜0.001）。該結(jié)果提示：通過鹽酸哌羅丁胺藥物灌胃構(gòu)建小鼠便秘模型能夠顯著改變小鼠的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)。同時(shí)，與便秘小鼠相比，給予市售奶粉、低中高劑量的自制奶粉對便秘小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)也有顯著影響。

圖2 基于Bray-Curtis距離的PCoA分析Fig.2 PCoA analysis based on Bray-Curtis distance

2.3.3 糞便微生物組成分析 進(jìn)一步對腸道微生物的物種組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。本研究發(fā)現(xiàn)：在門水平，相對豐度Top8的優(yōu)勢菌門包括Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、Candidatus_Saccharibacteria、 Actinobacteria、 Tenericutes、 Verrucomicrobia和 Armatimonadetes（圖3a）。其中 Bacteroidete和Firmicutes的相對豐度最高，可占到80%以上，其次是Proteobacteria，約占5%～10%。ANOVA分析發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，便秘模型小鼠的Proteobacteria的相對豐度顯著降低。高劑量的自制奶粉可以顯著增加便秘小鼠Firmicutes，降低Bacteroidetes的相對豐度。在屬水平上，相對豐度Top20的優(yōu)勢菌屬包括Lactobacillus、Alistipes、Barnesiella、Alloprevotella、Prevotella、Bacteroides、Helicobacter、Clostridium_XlVa、Escherichia_Shigella、Ruminococcus、Parabacteroides、Odoribacter、Incertae_sedis、Oscillibacter、Bifidobacterium、Clostridium_IV、Flavonifractor、Acetatifactor、Turicibacter和Lachnospiracea_incertae_sedis（圖3b）。ANOVA分析發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，小鼠便秘模型的Allobaculum、Escherichia_Shigella的相對豐度降低，Clostridium_IV、Erysipelotrichaceae_incertae_sedis的相對豐度顯著（P＜0.05）升高。而市售奶粉與低中高劑量的自制奶粉均可降低Erysipelotrichaceae_incertae_sedis的相對豐度。高劑量自制可奶粉可以顯著（P＜0.05） 升高Lactobacillus的相對豐度。

圖3 物種組成堆疊柱狀圖Fig.3 Stacked bar diagram of species composition

2.3.4 糞便微生物 LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size）分析 通過LEfSe分析進(jìn)行組間差異物種分析，以期找到各組間在相對豐度上有顯著差異的物[26-27]。圖4a展示了屬水平上LDA score大于2.0的差異物種，即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種標(biāo)志物，柱狀圖的長度代表顯著差異物種的影響大小。本研究發(fā)現(xiàn)：空白對照組的優(yōu)勢菌屬包括Barnesiella和Escherichia_Shigella。便秘模型組的優(yōu)勢菌屬包括Odoribacter和Clostridium_IV。便秘模型+市售產(chǎn)品組的優(yōu)勢菌屬包括Ruminococcus。便秘模型+低劑量組的優(yōu)勢菌屬包括Turicibacter、Bifidobacterium、Flavonifractor。便秘模型+高等劑量組的優(yōu)勢菌屬包括乳酸菌屬（Lactobacillus）。圖4b展示了差異物種的進(jìn)化分支圖。由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門至屬的分類級別。在不同分類級別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類，小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。無顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種顏色與分組顏色一致。圖中英文字母表示的物種名稱在右側(cè)圖例中進(jìn)行展示。

圖4 LEFSe分析Fig.4 LEFSe analysis

進(jìn)一步通過LEfSe方法比較發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，便秘模型組有顯著富集的Odoribacter和Clostridium_IV（見圖5）。先前的研究表明，致病菌Odoribacter、Clostridium與腸道并發(fā)癥如結(jié)腸炎的發(fā)生有關(guān)，添加雙歧桿菌（Bifidobacterium）能夠緩解便秘模型小鼠的癥狀，在屬水平上增加乳酸菌（Lactobacillus）的豐度，降低Alistipes、Odoribacter和Clostridium的水平[28]。這與本文的結(jié)果存在一致性。市售產(chǎn)品是能夠顯著改善便秘癥狀的潤腸通便的奶粉，本文的研究發(fā)現(xiàn)添加市售產(chǎn)品能夠提高便秘小鼠Lactobacillus和瘤胃球菌（Ruminococcus）的相對豐度，降低Odoribacter和Clostridium_IV的相對豐度。低劑量的自制產(chǎn)品能夠顯著增加Ruminococcus和Bifidobacterium的相對豐度，中高劑量的自制產(chǎn)品可能顯著增高Lactobacillus的相對豐度（圖6）。

圖5 LEFSe分析Fig.5 LEFSe analysis

圖6 LEFSe分析Fig.6 LEFSe analysis

綜上所述，通過鹽酸哌羅丁胺藥物灌胃構(gòu)建小鼠便秘模型，雖然沒有明顯改變腸道微生物的豐富度和均勻度，但是能夠顯著改變小鼠的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)組成，主要表現(xiàn)為Odoribacter和Clostridium_IV的顯著富集。添加市場產(chǎn)品和自制產(chǎn)品均能改善便秘小鼠的癥狀，并能顯著增加某些益生菌Lactobacillus、Bifidobacterium和Ruminococcus的相對豐度。因此，胃腸道調(diào)理專用奶粉可能是通過調(diào)節(jié)益生菌種類改變腸腔內(nèi)環(huán)境，影響腸道的運(yùn)動(dòng)和分泌，從而緩解便秘。

2.4 糞便質(zhì)量的測定

由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠首粒排便時(shí)間、首粒排藍(lán)便時(shí)間顯著增加（P＜0.05）、6 h排便總粒數(shù)顯著減少（P＜0.05），說明便秘模型造模成功。與模型組比較，陽性對照組首次排便時(shí)間和6 h排便粒數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05），表明市售奶粉雖然有一定胃腸道調(diào)理作用但不明顯，陽性對照組與低劑量組在首次排便時(shí)間、排藍(lán)便時(shí)間、6 h排便總粒數(shù)均出現(xiàn)顯著差異，表明低劑量專用奶粉作用效果與陽性對照組作用相似。自制胃腸道調(diào)理專用奶粉具有顯著促進(jìn)便秘小鼠首次排便時(shí)間和首次藍(lán)便時(shí)間的作用，且呈劑量相關(guān)性。增加胃腸道調(diào)理專用奶粉的劑量，則增加了促進(jìn)小鼠排便的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與翟紅梅等[29]在探究益生元奶粉對大鼠排便的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類似。而不同劑量組之間的6 h排便粒數(shù)沒有顯著差異（P＞0.05），分析原因可能與糞便大小不同、以及糞便軟硬程度和含水量不同。

表3 胃腸道調(diào)理專用奶粉對小鼠首粒排便時(shí)間、首粒排藍(lán)便時(shí)間和6 h排便粒數(shù)和糞便性狀的影響Table 3 Effects of special milk powder for gastrointestinal tract conditioning on the time of first defecation, the time of first blue defecation, the number of defecation grains and fecal traits at 6 h in mice

2.5 小腸推進(jìn)作用變化

表4顯示，模型組伊文思藍(lán)的推進(jìn)率與空白組伊文思藍(lán)的推進(jìn)率相比有顯著差異（P＜0.05），這說明在鹽酸洛哌丁胺作用下成功建立了小鼠的便秘模型。小鼠灌胃不同劑量胃腸道調(diào)理專用奶粉14 d后，墨汁推進(jìn)率在陽性對照組與模型組間無顯著差異（P＞0.05），而低、中、高劑量組小鼠的伊文思藍(lán)推進(jìn)率較模型組均有顯著增加（P＜0.05），說明胃腸道調(diào)理專用奶粉可以促進(jìn)小鼠的腸道蠕動(dòng)，并且隨著劑量的增加，伊文思藍(lán)推進(jìn)率也隨之提高。而陽性對照組市售奶粉雖有作用，但表現(xiàn)不明顯。此結(jié)論與劉萌穎[30]在探究奶粉中不同低聚糖添加量對小鼠潤腸通便腸推進(jìn)的影響作用結(jié)果相一致。表明含有低聚糖和亞油酸的胃腸道調(diào)理專用奶粉可以促進(jìn)和增強(qiáng)小鼠小腸的推進(jìn)力。而低劑量組和中劑量組體現(xiàn)出相似的推進(jìn)率。

表4 胃腸道調(diào)理專用奶粉對小鼠小腸推進(jìn)作用的影響Table 4 Effect of special milk powder for gastrointestinal tract conditioning on small intestine propulsion in mice

3 討論

大量研究表明，亞油酸具有調(diào)節(jié)腸道菌群，影響腸道微生態(tài)的潛在功能[31-32]。通過給大鼠灌服功能性低聚糖可以調(diào)節(jié)其體內(nèi)腸道菌群，促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)[33-34]。本試驗(yàn)通過對小鼠腸道菌群及胃腸道調(diào)理效果的測定，探究胃腸道調(diào)理專用奶粉中復(fù)配低聚糖和共軛亞油酸對腸道益生功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明胃腸道調(diào)理專用奶粉可縮短小鼠首粒排便時(shí)間、增加小腸推進(jìn)率，不影響小鼠小腸壁的杯狀細(xì)胞。胃腸道調(diào)理專用奶粉也能夠調(diào)節(jié)小鼠糞便菌群，雖然沒有明顯改變腸道微生物的豐富度和均勻度，但是能夠顯著改變小鼠的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)組成，主要表現(xiàn)為Odoribacter和Clostridium_IV的顯著富集。添加市場產(chǎn)品和自制產(chǎn)品均能改善便秘小鼠的癥狀，并能顯著增加某些益生菌Lactobacillus、Bifidobacterium和Ruminococcus的相對豐度。因此，添加自制產(chǎn)品可能是通過調(diào)節(jié)益生菌種類改變腸腔內(nèi)環(huán)境，影響腸道的運(yùn)動(dòng)和分泌，從而緩解便秘。

錢成等[35]在通過喂養(yǎng)小鼠含共軛亞油酸功能組分的配方食品后發(fā)現(xiàn)能調(diào)節(jié)腸道菌群豐富度，抑制促炎癥因子。趙銘琪等[36]通過體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同低聚糖劑量組的嬰兒配方乳粉對小鼠腸道推進(jìn)的影響作用不同，喂養(yǎng)含5.5 g/100 g低聚糖的乳粉對小鼠通便效果較好。Angeliki等[37]連續(xù)給嬰幼兒喂養(yǎng)含有低聚果糖的配方奶粉，低聚糖喂養(yǎng)組相比安慰劑組排便頻率顯著增加，并且糞便中雙歧桿菌占比大幅增加。周水岳[38]在觀測配方奶粉中添加低聚糖對大鼠影響過程中發(fā)現(xiàn)，添加低聚糖的配方奶粉顯著提高了大鼠的養(yǎng)分表觀消化率和小腸中某些酶活性。Finegold等[39]通過給予受試者低聚木糖收集糞便進(jìn)行微生物分類測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予功能性低聚木糖可顯著增加腸道菌群中總厭氧菌和擬桿菌兩種菌的豐度，同時(shí)得出補(bǔ)充低聚木糖可能有利于胃腸道微生物群。Hartigh等[40]研究發(fā)現(xiàn)在給予共軛亞油酸的小鼠糞便中，乙酸和丁酸的濃度顯著升高，同時(shí)，通過每日給小鼠補(bǔ)充膳食共軛亞油酸后，經(jīng)過高通量DNA測序檢測發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群發(fā)生較大變化，致病菌有顯著降低的情況。

通常情況下，腸道菌群物種組成多樣性降低被認(rèn)為是與疾病的發(fā)生有關(guān)。但是Ma等[41]通過薈萃分析比較了先前發(fā)表的27項(xiàng)人類微生物群相關(guān)疾?。∕icrobiome-associated diseases，MAD）研究中健康個(gè)體和患病個(gè)體的微生物多樣性和組成，提出菌群多樣性與菌群相關(guān)疾病沒有統(tǒng)計(jì)上嚴(yán)格的相關(guān)關(guān)系，微生物組的總體物種多樣性并不是疾病的可靠指標(biāo)。與非便秘自閉癥兒童相比，便秘自閉癥兒童的腸道菌群Alpha多樣性增加，該結(jié)果提示便秘可能增加了自閉癥患者體內(nèi)腸道菌群的異質(zhì)性特征[42]。但是最近也有一項(xiàng)臨床研究證明：糞菌移植（Fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）能夠重塑便秘患者的腸道微生物群，緩解臨床癥狀，增加菌群的alpha多樣性，提示更加豐富的腸道菌群多樣性可能更有利于便秘的緩解[43]。因此，目前關(guān)于腸道菌群多樣性在便秘發(fā)生中的作用，以及改善菌群多樣性是否能夠有助于緩解便秘的問題沒有得到一致的結(jié)論，有待大樣本、多個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣的縱向研究[44]。

腸道微生態(tài)失調(diào)是便秘的一個(gè)重要特征，本文的研究也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。腸道菌群能通過初級膽汁酸（Bileacids，BAs）[45]、短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFAs）[46]和 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等多種代謝產(chǎn)物介導(dǎo)便秘的發(fā)生。先前的研究表明益生菌對便秘的治療作用通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成和功能變化，涉及丁酸和神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生[47]。自制奶粉的主要成分-低聚糖與腸道菌群的相互作用關(guān)系最近也引起了廣泛關(guān)注。膳食結(jié)構(gòu)中含有低聚糖能夠影響腸易激綜合征患者的腸道菌群組成[48]。SCFAs等腸道菌群代謝產(chǎn)物也可以作為腸道刺激素通過激活分布在腸道平滑肌細(xì)胞、腸神經(jīng)元和腸上皮細(xì)胞上的特異性受體來影響腸道的感覺、分泌和運(yùn)動(dòng)，從而調(diào)節(jié)腸道功能，影響便秘[49]。自制奶粉的另一種主要成分亞油酸，是一種多不飽和脂肪酸，可通過宿主受體信號(hào)通路調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[50]。魔芋葡甘聚糖是一種功能性低聚糖，對便秘小鼠有促排泄作用，其機(jī)制可能涉及調(diào)節(jié)某些氨基酸生物合成（即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）、亞油酸代謝、次級代謝物生物合成和花生四烯酸代謝信號(hào)通路[51]。因此，自制奶粉可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成和代謝產(chǎn)物的生成，對便秘產(chǎn)生影響。

Xie等[52]發(fā)現(xiàn)FMT可緩解便秘癥狀，改變便秘患者的糞便微生物組Alpha和Beta多樣性，F(xiàn)MT后小鼠糞便菌群的 Actinobacteria（Bifidobacterium），Proteobacteria（Escherichia）和Firmicute（Lactobacillus）的相對豐度顯著增加。生育期便秘婦女的腸道菌群也表現(xiàn)Proteobacteria水平的顯著下降[53]。這與本文的結(jié)果存在一致性，提示Proteobacteria水平的降低可能與便秘的發(fā)生有關(guān)。Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比率被認(rèn)為對維持正常腸道內(nèi)環(huán)境平衡具有重要作用。低聚糖可通過增加糞便含水量和小腸轉(zhuǎn)運(yùn)率來治療便秘。添加低聚糖的便秘小鼠的腸道微生物群以Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria為主[28]。另外，便秘型腸易激綜合征患者也表現(xiàn)出Erysipelotrichaceae的顯著升高，而添加益生菌能夠改善功能性便秘患者的腸道功能，伴隨著Ruminococcaceae水平的升高和Erysipelotrichacea水平的顯著降低。因此，腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的變化可能與便秘的發(fā)生和緩解有關(guān)。

研究表明，致病菌Odoribacter、Clostridium與腸道并發(fā)癥如結(jié)腸炎的發(fā)生有關(guān)。添加雙歧桿菌（Bifidobacterium）能夠緩解便秘模型小鼠的癥狀，在屬水平上增加乳酸菌（Lactobacillus）的豐度，降低Alistipes、Odoribacter和Clostridium的水平[28]。這與本文的結(jié)果存在一致性。市售產(chǎn)品是現(xiàn)在公認(rèn)的能夠顯著改善便秘癥狀的潤腸通便的奶粉，本文研究發(fā)現(xiàn)添加市售產(chǎn)品能夠提高便秘小鼠Lactobacillus和瘤胃球菌（Ruminococcus）的相對豐度，降低Odoribacter和Clostridium_IV的相對豐度。低劑量的自制產(chǎn)品能夠顯著增加Ruminococcus和Bifidobacterium的相對豐度，中高劑量的自制產(chǎn)品可能顯著增高Lactobacillus的相對豐度（圖6）。Lactobacillus是最常用的益生菌之一，先前的研究表明，Lactobacillus能夠顯著改善兒童功能性便秘。Lactobacillus可通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸、降低腸道腔內(nèi)pH和促進(jìn)結(jié)腸蠕動(dòng)，這與該菌影響結(jié)腸肌電細(xì)胞的頻率和速度有關(guān)[54]。Lactobacillus acidophilus和Bifidobacterium bifidum也可通過釋放神經(jīng)信號(hào)來加快腸道運(yùn)動(dòng)[55]。用特定無病原體微生物群的定植能夠小腸移行運(yùn)動(dòng)復(fù)合體恢復(fù)正常[56]，Lactobacillus acidophilus、Bifidobacterium bifidum的定植能夠使無菌大鼠的小腸移行運(yùn)動(dòng)復(fù)合體和腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間恢復(fù)正常[57]。Strati等[58]研究了自閉癥患者便秘和非便秘患者腸道微生物群，發(fā)現(xiàn)腸道中的Ruminococcus與便秘癥狀負(fù)相關(guān)。

4 結(jié)論

不同劑量的胃腸道調(diào)節(jié)專用奶粉均能縮短小鼠的首次排便時(shí)間，提高腸道推進(jìn)率，但不損害小鼠小腸杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)。且隨著劑量的提升，胃腸道調(diào)理專用奶粉的功能效果越好。陽性對照組的市售奶粉雖然具有一定功能，但效果不及胃腸道調(diào)理專用奶粉。腸胃調(diào)理用奶粉雖未明顯改變腸道微生物的豐富度和均勻度，但可以明顯改變小鼠腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)的組成，明顯增加一些益生菌乳酸桿菌和雙歧桿菌的相對豐度。同時(shí)驗(yàn)證在奶粉中添加復(fù)配低聚糖和不飽和脂肪酸達(dá)到潤腸通便的可行性，此項(xiàng)研究結(jié)果為低聚糖和不飽和脂肪酸在功能性奶粉的應(yīng)用開發(fā)提供一定理論支持。